猪瘟圆环和蓝耳病毒病混合感染的诊断及防治
s after three diseases infected piglets to reduce farm losses and provide a reference for future research.猪瘟（swine fever）是由猪瘟病毒引起的一种急性或慢性、热性和高度接触性传染病。其特征为发病急、高热稽留和细小血管壁变性，引发全身泛发性小点出血，脾梗死。特别是全身淋巴结出血、肿大[1,2]。猪瘟呈世界性分布，由于其危害性高，对养猪业造成经济损失巨大，所以世界动物卫生组织（OIE）将本病列入法定的A类传染病，并规定为国际重点检疫对象。本病的主要传染源为病猪和带毒猪，易感猪和病猪的直接接触是病毒传播的主要方式，本病一年四季均可发生，一般以春、秋较为严重。在常发区，猪群有一定的免疫力其发病率和死亡率较低，在新疫区，发病率和死亡率在90%以上。猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由病毒引起的猪的一种繁殖障碍和呼吸系统的传染病。其特征为厌食、发热，怀孕后期发生流产，产死胎和木乃伊胎；幼龄仔猪发生呼吸系统疾病和大量死亡。因为部分病猪的耳部发紫，又称“猪蓝耳病”。本病只感染猪，各年龄和品种的猪均易感，但主要侵害繁殖母猪和仔猪。病猪和带毒猪是主要的传染源，本病传播迅速，主要经呼吸道感染，也可以垂直传播。PRRSV 容易发生变异，最直接有力的证据就是高致病性蓝耳病病毒毒力增强的现象[3,4,5,6]。高致病性蓝耳病其变异主要表现在GP5基因的点突变和Nsp2基因缺失[7]。该病首先暴发于美国，随后传播到世界各地，给世界养猪业造成巨大的经济损失[8,9]。近年来，随着养猪业的集约化和规模化发展，关于猪瘟和猪蓝耳病的混合感染常有报道[10]。猪圆环病毒感染（porcine circovirus infection）是由猪圆环病毒引起的猪的一种新的传染病。其主要特征为体质下降、消瘦、贫血、黄疸、生长发育不良、腹泻、呼吸困难、母猪繁殖障碍、内脏器官和皮肤的广泛病理性变化，特别是肾、脾脏及全身淋巴结的高度肿大出血和坏死。本病还可以导致猪群产生严重的免疫抑制，从而容易导致继发或并发其它传染病。猪是圆环病毒（porcine circovirus,PCV）的主要宿主。各种年龄的的猪均可感染，但仔猪感染后发病严重。血清学调查发现，国外猪群的PCV阳性率达20%~80%，国内阳性率也达52.8%～100%[11]。材料与方法1.1材料海安大公镇某猪场于2015年4月左右在某集市交易市场分别从不同商家购买了600头20日龄断奶仔猪，该猪场将600头猪分成了两批，一批养于1号舍，一批养于2号舍。该猪场技术人员于购买猪的第2天在2号舍接种了天津株猪高致病性蓝耳活疫苗后，第3天猪群出现发热、气喘、部分仔猪腹下皮肤出现紫色，猪场工作人员紧急注射阿莫西林抗生素，无效。在5月8号送检前，2号舍300头发病猪已经死亡150头，发病率100%，死亡率达50%。1号舍没有接种活疫苗，猪群表现稳定。送检一共4头猪，两头死猪，两头发病活猪。剖检观察后采集肺脏、脾脏、淋巴结等材料。试剂盒1组成1.猪瘟病毒抗原包被微孔板条96T×2 2.酶标记物2 2mL×1 3.样品稀释液50 mL×1 4.显色剂A12 mL×1 5.显色剂B 12 mL×1 6 洗涤液（用前125稀释）50 mL×1 7.猪瘟病毒抗体阳性对照血清 1.5 mL×1 8.猪瘟病毒抗体阴性对照血清 1.5 mL×1 9.终止液 12 mL×1 10.封口膜 6张.试剂盒2组成1.猪蓝耳病毒抗原包被微孔板条 96T×2 2.酶标记物2 2 mL×1 3.样品稀释液 50 mL×1 4.显色剂A 12 mL×1 5.显色剂B 12 mL×1 6.洗涤液（用前125稀释） 50 mL×1 7.猪蓝耳病毒抗体阳性对照血清1.5 mL×1 8.猪蓝耳病毒抗体阴性对照血清 1.5 mL×1 9.终止液 12 mL×1 10.封口膜 6张 试剂Taq酶、RNAislater、氯仿、异丙醇、RNase free ddH2O、5*RTsupermix、引物CSFV1、引物CSFV2、引物PCV1、引物PCV2、引物PRRS1、引物PRRS21.2方法1.2.1临床症状与病理剖解 发病期，猪群的猪食欲减退，进而不吃不喝，表现呆滞，行动迟缓，出现发抖。病猪眼结膜发炎，多有粘液，眼睑浮肿，精神沉郁，打喷嚏，嗜睡，体温升高，连续3-4d体温达42℃，有的猪腹下、耳尖、四肢末梢等处发红或发紫。随着病程的发展，仔猪进而消瘦，出现黄疸，下痢，呼吸越来越困难，出现运动障碍，最终发生死亡。剖解海安送来的两头发病死猪，两头发病活猪可以发现，病猪消瘦，死猪尸体僵直，皮肤发红，腹下皮肤可见针尖状出血点。全身内脏器官、黏膜、浆膜等均有不同程度的出血变化。全身淋巴结特别是颌下、腹股沟、肺、肠系膜（见图1）等出血肿大，切面呈大理石样外观，有液体渗出，心肌变软、心包膜增厚、心内膜充血；肝脏肿大、有白色结节；肺呈花斑样，间质明显增宽，个别病猪肺膈叶前缘中部有肉样变或胰样变，切开有少量液体（见图2）。喉头可见针尖样出血点，扁桃体充血，甚至有化脓性溃疡灶。肾脏、脾脏有黄白色疱疹样坏死灶，肾脏表面有针尖样小出血点（见图3），脾未见肿大，边缘有出血性梗死。小肠充血出血，回盲瓣处有糠麸样溃疡。图1.肠系膜出血 图2.肺脏出血肉变 图3.肾表面有针尖出血点1.2.2实验室镜检与药敏试验1.2.2.1涂片镜检 操作流程取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用笔画一个小圈用于标记。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。涂片先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环伸入肺部蘸取黏液，涂在载玻片上，使其薄而均匀。晾干让涂片在空气中自然干燥。固定让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定。染色将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。水洗用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。媒染滴加1滴碘液，染1min，水洗。脱色吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。复染滴加沙黄染液复染1min，水洗。干燥后用光学显微镜进行观察。1.2.2.2药敏试验操作流程用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。1.2.3猪瘟病毒与蓝耳病毒试剂盒检测1.2.3.1猪瘟病毒ELISA抗体检测 猪瘟常规的血清学检测方法主要有病毒中和试验、间接血凝试验、间接免疫荧光试验、ELISA、胶体金免疫层析等，其中间接ELISA具有简单、快捷、敏感、特异、高通量等优点，在猪瘟的抗体检测上得到了广泛应用[12]。操作流程别将50 uL样品稀释液加入每个检测孔和对照孔中，别将50 uL的阳性对照和阴性对照加入，应的对照孔中，注意不同对照的吸头要更换，以防污染，别将50 uL的被检样品加入剩下的检测孔中，注意不同检样的吸头要分开，以防污染，弹微量反应板或用振荡器振荡，使反应板中的溶液混匀，微量反应板用封条封闭置于湿箱中（18～25℃）孵育2小时，也可以将微量反应板用封条置于湿箱中孵育过夜，出反应孔中的液体，并用稀释好的洗涤液洗涤3次，注意每次洗涤时都要将洗涤液加满反应孔，将100 uL的兔抗猪二抗加入反应孔中，用封条封闭反应板并于室温下或湿箱中孵育30分钟，洗板后，分别将100 uL的底物溶液加入反应孔中，于避光、室温条件下放置10分钟，在每个反应孔中加入100 uL终止液终止反应。1.2.3.2猪蓝耳病毒IgG抗体检测操作流程取所所需用量包被微孔板条，设空白、阴性及阳性对照各2孔，未用的板条尽快密封，2～8℃保存。 阴性、阳性对照孔分别加阴性、阳性对照100 uL稀释液；品孔样本1100稀释后加100 uL；空白对照孔不加。混匀，置37℃温浴30分钟。倒掉孔内液体，每孔加满洗涤液，静置60秒后弃去，重复洗涤5次，拍干。每孔加酶标记物100 uL（空白孔除外）。置37℃温浴30分钟。洗涤。 每孔依次加显色剂A、显色剂B各50 uL，混匀，37℃避光反应10分钟。每孔加终止液50 uL，混匀，置酶标仪450nm处测各孔A值。1.2.4 RT-PCR检测RNA和DNA提取取患猪的肺、淋巴结、肾等组织，无菌条件下剪取约2g的组织病料，加入3倍体积的TE缓冲液研磨成悬液。200 uL原液加上800uLRNAislater剧烈摇晃，静置5min；加入200 uL氯仿，剧烈摇晃静置5min；12000r/min 4℃ 离心15min；取上清400 uL加入400 uL异丙醇，轻微震荡，沉淀2h，置于-20℃；12000r/min 4℃ 离心15min；吸尽液体，再用1 mL 75%乙醇润洗；12000r/min 4℃ 离心15min；再吸尽液体；加入10-20 uL ddH2O溶解，取1 uL做RT-PCR。RT反应体系RNase free ddH2O 7 uL；5*RT supermix 2 uL；样品1 uL；组成10 uL体系。反应条件为30℃ 10min；45℃ 1h；72℃ 10min；4℃保存。PCR扩增体系（见图4）种类25uL体系(uL)ddH2O9.5*3.32*Taq plus master mix12.5*3.3模板1*3.3引物CSFV11引物CSFV21引物PRRS11引物PRRS21引物PCV11引物PCV21 图4 PCR扩增体系分装3孔，CSFV病毒扩增条件为95.0℃ 5min；95.0℃变性 30s，55.0℃退火30s，72.0℃延伸30s进行35个循环；72.0℃延伸10min。PRRS病毒扩增条件为95.0℃5min；95.0℃变性 30s，53.5℃退火30s，72.0℃延伸30s进行35个循环；72.0℃延伸 10min。PCV病毒扩增条件为95.0℃5min；95.0℃变性30s，54.0℃退火30s，72.0℃延伸 30s进行35个循环；72.0℃延伸10min。反应结束后，PCR产物于1%琼脂糖进行凝胶电泳，采用自动凝胶成像扫描仪进行拍照。1.2.5间接免疫荧光实验 将已接好PCV病毒并固定好PK15细胞的96孔板弃去培养液，用PBS洗一遍，拍干；向每孔加入预冷丙酮:乙醇（6:4）室温固定10min，拍干，用PBS洗一次，再拍干；向每孔中加入阳性血清（1:50）50 uL，37℃，1h，用PBS洗3次，自然干燥；向每孔中加入羊抗猪荧光二抗（1:200）50 uL，37℃，45min，用PBS洗3次；1:9磷酸-甘油封底，用倒置显微镜观察。结果2.1镜检和药敏试验结果 在肺间质中发现较小革兰氏阴性杆菌，由于实验室条件有限未进一步作鉴定。药敏结果（见图5）序号123456789类型普卡青霉素氧氟沙星阿奇泰伦阿莫西林氟苯尼考磺胺培氟沙星头孢喹纳头孢噻呋钠硫酸阿米卡星药效-++------+++ 图5 不同药物对病猪肺间质中革兰氏阴性杆菌作用的药效图 从图5中可以看出，氧氟沙星和阿米卡星对这种阴性革兰氏杆菌的作用较为明显，故可在饲料中添加这两种药物以降低细菌病发生的概率。2.2猪瘟病毒ELISA抗体检测结果 结果判定计算样本和对照的平均吸光度值。计算方法如下计算被检样本的平均值OD450（＝ODTEST）、阳性对照的平均值（＝ODPOS）、阴性对照的平均值（＝ODNEG）。根据以下公式计算被检样本和阳性对照的阻断率； 阻断率＝（ODNEG- ODTEST）/ ODNEG×100% 。验有效性阴性对照的平均OD450>0.50；对照的阻断率应>50%。结果判定如果被检样本的阻断率大于或等于40％，该样本被判定为阳性（有CSFV抗体存在）。如果被检样本的阻断率小于或等于30％，该样本被判定为阴性（无CSFV抗体存在）。本实验结果阻断率>50%,故判为阳性，有CSFV抗体存在。2.3猪蓝耳病毒IgG抗体检测结果结果判定以空白对照调零用酶标仪于450nm读取吸光度A值。试验成立的条件是阳性对照孔A450值大于或等于0.5，阴性对照孔A450值必须小于0.15。样品A450值大于0.15+阴性对照孔均值，判为阳性；样品A450值小于0.15+阴性对照孔均值，判为阴性；如阴性对照孔均值小于0.05按0.05计算。本实验样品A450值大于0.15+阴性对照孔均值，故为阳性，说明存在IgG抗体。2.4 RT-PCR检测结果 1 2 3 4 5 图6 RT-PCR和PCR 扩增结果注:1.Maker DL 2000 ；2.PRRSV1；3.PRRSV2 4.PCV 5.CSFV RT-PCR和PCR的扩增结果显示PRRS1和PRRS2的大小在800bp左右，PCV的大小在250bp左右，CFSV的大小在250bp左右，与预期相符。2.5间接免疫荧光实验结果 图7 阴性血清对照图 图8 阳性血清对照图 图9 样品荧光图 从图7、8、9可以看出，样品的免疫荧光图与阳性血清对照图较为一致，说明PK-15细胞中存在PCV病毒。3.诊断与治疗3.1诊断 根据发病情况、临床症状和病理剖检变化以及实验室检测，可以判定本次海安大公镇某猪场发生了猪瘟、蓝耳和圆环病毒病的混合感染。3.2治疗疫苗治疗由于混合感染尚无特效药治疗，为防止该猪场死亡率继续升高，本实验室利用病猪组织内脏制作了部分自家苗，用于紧急接种[13]。西药治疗穿心莲针10～20 mL、氨苄青霉素0.025～0.04mg/千克体重、地塞米松 5～10 mg混合肌注,每天2次,连用5天。待症状好转时,剂量减半,再连用3天。中药治疗白头翁30g 、黄连12g、黄柏12g、秦皮15g、木香15g、槟榔 15g、白芍15g、陈皮20g、防风15g、茯苓20g、苡仁30g、甘草15g,一剂药煎水3次,分早、中、晚3次服完,每天一剂,连用3天。同时,在饲料中加喂维生素B、维生素C,连用5天。3.3防控措施3.3.1建立科学的饲养管理的制度 这样可以减少和杜绝疾病。规模猪场应首先将猪群按照猪的品种、性别、年龄、体重、强弱等分群分开饲养,同时要根据各种猪的营养要求来确定饲养标准和饲养方法。保持猪舍清洁舒适,通风良好。3.3.2自繁自养，全进全出 这样可以避免买猪时带进传染病。3.3.3无害化处理病猪 对病死猪焚烧后深埋，进行无害化处理。3.3.4加强人员培训 加强猪场工作人员防疫知识培训，牢固树立防重于治观念，严格落实猪场卫生管理和防疫措施。3.3.5做好免疫接种工作7～10日龄仔猪2 mL/头，150 日龄后备猪4 mL/头，母猪和种公猪每隔4个月注苗一次，4 mL/头。做疫苗前最好先进行抗体检测，阴性猪场使用灭活苗，阳性猪场使用弱毒苗。注意事项 在接种弱毒前先做几头试验，一周后无任何问题出现后再全群接种，如有问题应立即停止接种工作，排除隐患后方可继续。4.小结与讨论4.1 本次发病为猪瘟，蓝耳和圆环病毒的混合感染，近些年来，可以明显的感觉到单一发病的情况越来越少，取而代之的是越来越多的混合感染。有两种病的混合感染，也有三种病的混合感染，甚至有多达好几种同时发病的情况。单一的治疗方案已远远不能满足实际生产中的需要，更多的是需要我们采取综合防控方法进行全方位的监管预防，这样才能有效减少多种病混合感染的发生。4.2 猪瘟病毒属于黄病毒科瘟病毒属，其与同属的牛病毒性腹泻病毒的基因序列有高度的同源性，抗原关系密切，既有血清学交叉反应，又有交叉保护作用。有猪瘟流行的国家和地区，常采用疫苗接种，或疫苗接种辅之扑灭政策，以控制本病。在已发生猪瘟的猪群和地区，对假定未感染猪群进行紧急接种，可使大部分猪获得保护，控制疫情，对疫区周围猪群进行逐头免疫，形成安全带防治猪瘟蔓延。猪瘟免疫失败时有发生，原因较多，其主要由于亚临诊感染猪瘟病毒的怀孕母猪经胎盘感染胎儿，早期感染多发生流产，中期感染则产弱仔，出生后出现先天性震颤。这些猪可终生带毒，形成免疫耐受和持续感染，抗体水平低。可采用加大免疫剂量，肌肉注射100PD50。4.3 近年来，高致病性猪蓝耳病在我国大部分养猪省份普遍发生[14,15,16,17]。对于猪蓝耳病，目前尚无特效药物疗法，主要采取综合防治措施及对症疗法。最根本的方法是消除病猪、带毒猪和彻底消毒，切断传播途径。猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，不具血凝活性，对外界环境抵抗力极强，一般的消毒剂很难将其杀灭。PCV是致病的必要因素，但不是充分条件，必须在其他因素的共同参与下才能导致明显的和严重的临诊病症，除了常见的病原体外，还包括饲养管理不善、通风不良、免疫接种刺激、不同来源和日龄的猪混养等。圆环病毒病和蓝耳病均是猪的免疫抑制性疾病，导致猪的机体免疫力下降，甚至免疫失败，造成猪瘟、伪狂犬病、链球菌病、胸膜肺炎等多发及多种疾病混合感染[18]。这两种病由于在很多方面有着通性，故经常发生混合感染。为预防蓝耳病和圆环病毒病混合感染病，应改善猪群的饲养管理和环境条件，减少应激，保持呼吸系统屏障作用的完整性，正确使用疫苗和抗生素。4.4 在规模化养猪时，最好能自繁自养，坚持全进全出，种猪场至少也要做到产房和保育两个阶段的全进全出。坚持定期监测淘汰制度，发现病猪应尽快诊断、隔离、扑杀病猪，并作无害化处理，消除传染源。4.5 对于近些年来，猪场各种病的混合感染发病率一直上升，究其原因，缺乏科学的管理制度是一个重要的原因。科学的饲养管理，积极的消毒在制度可以减少疾病的发生。猪场因根据住的种类、大小、性别、体重、年龄等不同的因素分开来饲养猪群，并根据不同猪群的营养需要实行相对应的饲养方案。保持猪场清洁，良好的通风条件，合适的温度等对猪群能健康地生长都极为重要。4.6 近年来，疫病发生情况越来越复杂，多种疫苗的交替、大剂量、不规范使用，形成了免疫压力[19]。我们需要制定合理的免疫程序制度。不能当发病时才想到紧急疫苗接种。每个猪场因为饲养管理、猪群整体健康状况不同，疫苗免疫后产生抗体的快慢和保护时间也不尽相同。我们要根据相应的情况制定合理免疫程序，必须以抗体监测为基础，结合自身猪场管理现状，科学确定，不能人云亦云，适合自己的才是最重要的。致谢参考文献[1]伍少钦，肖有恩，吴志君.猪场疫病生物安全防控体系的建设[C]//2013中国猪业发展论文集.第三届全球猪业论坛暨第十一届（2013）中国猪业发展大会，201339-44.[2]覃勇，赵国山，卢少坤.百色市猪瘟免疫效果分析及CSFV感染状况调查[J].广西畜牧兽医，2010，26（6）353-355.[3] 王荣.猪瘟和蓝耳病快速检测方法的建立和应用[D].福州福建农林大学，2009.[4] 郑连湖，王宝峰，崔丽萍，等，猪高致病性蓝耳病的流行特点及防制措施[J].现代畜牧兽医，2010（7）42-43.[5] Mortensen S，Stryhn H，Sgaard R，et al. 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目录
摘要 1
Abstract. 1
Key words 1
1.材料与方法 2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1临床症状与病理剖解 2
1.2.2实验室镜检与药敏试验 3
1.2.2.1涂片镜检 3
1.2.2.2药敏试验 4
1.2.3猪瘟病毒与蓝耳病毒试剂盒检测 4
1.2.3.1猪瘟病毒ELISA抗体检测 4
1.2.3.2猪蓝耳病毒IgG抗体检测 4
1.2.4 RTPCR检测 4
1.2.5间接免疫荧光实验 5
2.结果 5
2.1镜检和药敏试验结果 5
2.2猪瘟病毒ELISA抗体检测结果 5
2.3猪蓝耳病毒IgG抗体检测结果 6
2.4 RTPCR检测结果 6
2.5间接免疫荧光实验结果 6
3.诊断与治疗 7
3.1诊断 7
3.2治疗 7
3.3防控措施 7
3.3.1建立科学的饲养管理的制度 7
3.3.2自繁自养，全进全出 7
3.3.3无害化处理病猪 7
3.3.4加强人员培训 7
3.3.5做好免疫接种工作 7
4.小结与讨论 7
猪瘟、圆环和蓝耳病毒病混合感染的诊断及防治
引言
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