家畜的繁殖力对生产的经济效益具有重要影响，繁殖力不仅与品种、饲养、环境因素有关，从配子生物学角度，还与家畜的卵子质量密不可分。细胞和分子生物学技术的发展促使人们对哺乳动物卵子质量的分子机理的研究更加深入，高尔基体相关因子影响卵母细胞不均等分裂的研究是动物繁殖的重要研究领域之一。Wiskott Aldrich Syndrome protein（WASP）家族蛋白是重要的肌动蛋白成核因子，其中N-WASP参与调控微丝组装。本研究探究哺乳动物卵母细胞的成熟过程中N-WASP的定位和表达，为探索卵母细胞成熟的分子机制提供基础理论支持。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料3
1.1 免疫荧光染色的抗体、试剂及设备3
1.1.1 抗体和试剂3
1.1.2 主要设备3
1.2 蛋白免疫印迹的抗体、试剂和设备4
1.2.1 抗体和试剂4
1.2.2 主要设备5
2.方法5
2.1 免疫荧光染色抗体的配制5
2.2 猪卵母细胞分离与成熟培养7
2.3 饱和湿度的培养箱7
2.4 免疫荧光染色和激光共聚焦观察7
2.4.1 免疫荧光染色步骤7
2.4.2 抗体8
2.4.3 激光共聚焦观察8
2.5 Cdc42抑制剂处理卵母细胞8
2.6 蛋白免疫印迹的抗体的配制9
2.7蛋白免疫印迹（Western Blot）10
2.7.1 实验步骤10
2.7.2 抗体和稀释倍数12
2.7.3 数据分析12
3. 结果12
3.1 NWASP在卵母细胞成熟过程的亚细胞定位12
3.2 NWASP在卵母细胞成熟各时期的蛋白表达14
4.讨论 15
4.1 NWASP的定位与其在卵母细胞成熟中的作用15
4.2 NWASP 在猪卵母细胞减数分裂过程中的表达与功能15
5.小结15 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 

致谢16
参考文献16
NWASP在卵母细胞成熟过程中的定位和表达
引言
引言
生命诞生这个生物学事件一般认为开始于精子与卵子的结合，功能性的精子和卵子对这个事件至关重要。一个功能性的卵子需从卵母细胞经过两次不均等的减数分裂形成，如果减数分裂的过程受到影响，那么不能产生正常的卵子从而影响受精。卵母细胞的减数分裂是一个复杂的生物学过程，是特殊的有丝分裂，在发育和成熟过程中会经历两次不均等的减数分裂。卵子由原始生殖细胞形成，在出生时，女性体内已有约（1~2）*106个原始卵泡，经过第一次减数分裂停留在第一次减数分裂前期（双线期），具有生发泡（germinal vesicle，GV）。生发泡破裂（germinal vesicle breakdown，GVBD）意味着卵母细胞开始成熟，具有极性的微管逐渐形成纺锤体使染色体排布在赤道板中央。初级卵母细胞经过一次减数分裂形成一个次级卵母细胞和一个体积较小的第一极体。第一极体的排出标志着MII期卵母细胞成熟。次级卵母细胞再经过一次分裂，如果受精，则形成体积较大的和一个体积较小的第二极体，第二极体的排出标志着受精的完成，减数分裂结束，形成合子（受精卵）。哺乳动物卵母细胞不均等的减数分裂是形成具有正常受精和发育能力的配子的关键。卵细胞是孕育生命的场所，通过不均等分裂最大限度地的将母源胞质物质保留于卵细胞中；卵细胞的细胞质在受精后能提供丰富的营养和稳定的环境，满足早期胚胎发育的需要。这正是卵母细胞不均等分裂的意义所在。
卵子的发育和成熟过程主要受两方面因素的调控：中枢神经内分泌的调节和卵巢微环境的细胞因子生物调控[1]。下丘脑 垂体 卵巢轴可释放一系列的激素，如促性腺激素、雌激素、雄激素等的分泌促使卵母细胞成熟；卵巢微环境中通过白细胞介素[2]、胰岛素样生长因子[3]、表皮生长因子[4]等直接调控卵子的发育和成熟。相关的分子调控机理还不够清晰明了。已有的研究表明细胞骨架（微丝、微管）参与卵母细胞不均等分裂和极化的调控。微丝相互交联形成一个具有动力性的细胞网络，影响着细胞形态和细胞运动。近年来很多研究发现微丝在传达细胞信号、调节细胞运动以及分裂中都具有重要作用。研究表明，卵母细胞不均等分裂的基础和前提条件是纺锤体的偏中心位置[5]；一些分子在第一次减数分裂和第二次减数分裂中期卵母细胞中分布于纺锤体两端，参与调控卵母细胞减数分裂纺锤体组装，例如BRCA1[6]、AuroraA[7]、PKC[8]、MEK[9]、Pololike kinase1[10]。微丝骨架对细胞极性的产生和细胞分裂至关重要，参与调控微丝骨架的因子有GTPbinding 蛋白——包括Rac[11]、Rho和Cdc42[12]，Arp2/3复合物[13]以及WASP蛋白家族[14]等。
本试验所要研究的NWASP是调节微丝聚集的核心因子之一；在调节卵母细胞减数分裂的分子信号通路中，Cdc42具有调控卵母细胞纺锤体的定位以及第一极体的形成的功能，其下游蛋白WASP家族中的WASP（WiskottAldrich syndrome protein）和NWASP能调节Cdc42在微丝骨架中的作用。以小鼠卵子为实验对象的研究结果表明在建立卵母细胞极性的NWASP是Cdc42/NWASP通路中Cdc42的下游蛋白[15]。在爪蟾卵提取物中发现NWASP使上游的Cdc42刺激的肌动蛋白聚集； NWASP的C端与下游Arp2/3复合物结合，促使肌动蛋白成核因子聚集[16]。RanGTP能影响NWASP在卵母细胞皮质重组的功能[17]。NWASP在哺乳动物卵母细胞不均等分裂过程中的亚细胞定位和分布情况是怎样的，尚无明确研究结果。本研究试图阐明，NWASP在哺乳动物卵母细胞成熟过程中表达情况、亚细胞定位情况以及不同时期NWASP的定位情况的变化。
材料
1.1 免疫荧光染色的抗体、试剂及设备
1.1.1抗体和试剂
兔多克隆抗NWASP抗体：英国Abcam公司，Cat.No：ab126626
FITC标记山羊抗兔IgG（H+L）：北京中山桥，Cat.No：ZF0311
鼠单克隆抗αtubulinFITC抗体：美国Cell Signaling Technology公司，Cat.No：70747
二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美国 SigmaAldrich 公司，Cat. No：D2650
羊毛脂（lanolin）：国药集团化学试剂有限公司，Cat. No：69014628
组织培养基 TCM199：美国 SigmaAldrich 公司，Cat. No：M2154
杜氏磷酸盐缓冲液（ PBS/DPBS ）： 美国 Life Technologies 公司，Cat. No：SH30028.01B
青霉素钾（penicillin）：山东鲁抗医药股份有限公司，Lot No：S090615
硫酸链霉素（streptomycin）：山东瑞阳制药有限公司，Lot No：10072901

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