肌卫星细胞是位于基膜与肌纤维膜之间具有增殖和自我更新能力的成体干细胞，是机体出生后肌肉中生肌前体的重要来源。由于骨骼肌细胞在体外难以连续培养，因此对骨骼肌生长发育的分子调控机制的研究主要是在体外培养肌卫星细胞的基础上实现的。本实验在已完成初步分离的基础上培养肌卫星细胞，并采用免疫荧光技术对培养的细胞进行鉴定。本实验提供了一种简洁高效的猪肌卫星细胞的培养、鉴定方法，为研究猪骨骼肌生长发育的分子机制奠定了良好的基础。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
1 引言 3
2 材料与方法 4
2．1 材料 4
2．2 试剂与仪器 4
2．2．1 仪器与耗材 4
2．2．2 主要试剂 4
2．3 方法 4
2．3．1 试剂配制 4
2．3．2 骨骼肌卫星细胞解冻 4
2．3．3 骨骼肌卫星细胞培养 4
2．3．4 骨骼肌卫星细胞形态观察 4
2．3．5 骨骼肌卫星细胞免疫荧光染色 5
2．3．6 骨骼肌卫星细胞增殖特性鉴定 5
3 结果与分析 6
3．1 骨骼肌卫星细胞形态 6
3．2 骨骼肌卫星细胞免疫荧光染色结果 6
3．3 骨骼肌卫星细胞的增殖特性 7
4 讨论 7
致谢 8
参考文献 8
猪骨骼肌卫星细胞的培养与鉴定
动物科学 周励夫
引言
1 引言
骨骼肌卫星细胞是位于基膜与肌纤维膜之间具有增殖和自我更新能力的成体干细胞。1961年, Mauro等人首次在青蛙骨骼肌中发现了肌卫星细胞，因其排列的位置及方式像是肌纤维的卫星而得名[1]。而直到1974年，Bischoff等人才首次从大鼠骨骼肌中分离出了有活性的肌卫星细胞[2]。而猪的骨骼肌卫星细胞最早是由Doumit和Merkel于1992年分离出来的[3]，之后人们对猪骨骼肌卫星细胞的分离研究都采用类似或者改进过的方法 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
。
对家畜来说，骨骼肌的生长是影响动物机体生长速度的主要原因，同时也是其肉制品的主要组成。一般来说，动物体出生后，肌细胞的数量是一定的，在生长过程中不会发生明显变化。因此，骨骼肌生长主要依靠肌细胞核数目增多和体积的增加[4]，当骨骼肌受到外界刺激时，其再生能力显著增强[5],其根本原因主要是肌细胞周围的卫星细胞激活后融入肌细胞中，增加了肌细胞DNA含量并使其蛋白质合成能力升高。此外，卫星细胞还能通过分化、相互融合形成新的肌纤维。
目前，对骨骼肌卫星细胞的分离主要有两种方法：（1）用酶消化切碎的肌肉组织，并对其进行吹打使骨骼肌卫星细胞从基膜与肌纤维膜之间被释放出来；（2）通过分离得到单根肌纤维并对其进行培养，使骨骼肌卫星细胞自发的从肌纤维中迁移出来。通过第一种方法分离得到的细胞含有较多的杂质，如成肌细胞、成纤维细胞等，因此还需通过一定的方法对其进行纯化才能得到纯度较高的卫星细胞，该方法具有简单方便的优点。第二种方法，基于分离完整的肌纤维进行培养，便于研究卫星细胞的原始位置及其子代从肌纤维上的迁移、自我更新、增殖、分化和融合等过程，且获得的卫星细胞再生能力强，并且更接近于骨骼肌卫星细胞的活体研究[6]。
本研究在前人的研究基础之上，采用优化的酶切消化成功获得了高纯度的肌卫星细胞，并采用免疫荧光技术对其进行了鉴定。本研究为深入开展骨骼肌生长发育的分子调控机制、阐明猪生长发育的分子机制奠定良好的基础。
2 材料与方法
2．1 材料
以液氮中冻存的猪骨骼肌卫星细胞为实验材料。
2．2 试剂与仪器
2．2．1 仪器与耗材
水浴锅、离心机、培养箱、光学显微镜、激光共聚焦显微镜、分光光度计、盖玻片、聚丙烯离心管，T25培养瓶，冷冻管，培养板（6孔板、96孔板）。
2．2．2 主要试剂
高糖DMEM培养基/DMENHG (Gibco)；胎牛血清/FBS(Gibco)；磷酸缓冲液/PBS(Braun Co.)；100×青霉素链霉素混合液/100×PenStrep (Gibco)；胰蛋白酶/0.25% TrypsinEDTA(Gibco)
2．3 方法
2．3．1 试剂配制
含20%胎牛血清的增殖培养基（PM）：将高糖DMEM培养基与胎牛血清按照4:1的比例配制，再用其将青链霉素混合液稀释100倍，使青霉素与链霉素最终浓度分别为100 U/ml和100μg/ml。该溶液可储存于4℃备用也可临时制备。
磷酸缓冲溶液+（PBS+）：将浓度100X的青链霉素混合液用PBS稀释100倍，使青霉素与链霉素最终浓度分别为100 U/ml和100μg/ml。将其储存于4℃备用。
含2%马血清的分化培养基：将高糖DMEM培养基与马血清按照98:2的比例配制，4℃储存备用，存放时间不宜过长。
2．3．2 骨骼肌卫星细胞解冻
（1）将水浴锅预热至37℃；
（2）从液氮中取一冻存管，投入到水浴锅中迅速解冻。在解冻的过程中需适时摇动，使冻存管内液体能迅速融化；
（3）将细胞悬液转移到15ml聚丙烯离心管中，加入2ml冷的PM并调整至15ml；
（4）在5000g下离心5min后收集细胞沉淀；
（5）去掉管中上清液，将细胞沉淀再用3ml PM重新悬浮细胞，并将细胞接种至T25细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO2条件下培养。
2．3．3 骨骼肌卫星细胞培养
解冻后的细胞培养至贴壁3天后，去除旧的培养液，用温的PBS+清洗，之后添加新的PM培养液继续培养。待培养瓶中细胞达到80%左右融合时，去除培养液，PBS漂洗后用0.25%的胰蛋白酶（含0.038%的EDTA4Na）处理，消化2min左右，加入PM培养液终止消化，并按照1:2的比例接种至新的T25培养瓶，置于37℃、5%CO2条件下进行传代培养。
2．3．4 骨骼肌卫星细胞形态观察
（1）取培养至第二代的细胞，去除瓶中培养液，用0.25%的胰蛋白酶消化后加入PM培养基制成细胞悬液；
（2）在接种细胞前，向板孔中滴加少培养基，并放入大小合适且无菌的盖玻片，以便于接种后细胞爬片；
（3）将细胞悬液以104个细胞每孔的密度接种至6孔板，置于37℃、5%CO2条件下过夜培养；
（4）细胞分化利用2%的马血清培养基进行诱导分化，用倒置显微镜观察细胞形态以及生长状况，并拍照记录。
2．3．5 骨骼肌卫星细胞免疫荧光染色
（1）取培养至第二代的细胞，去除瓶中培养液，用0.25%的胰蛋白酶消化后加入PM培养液制成细胞悬液；
（2）在接种细胞前，向板孔中滴加少量PM培养液，并放入大小合适且无菌的盖玻片，以便于接种后细胞爬片；

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