MMPs参与豚鼠卵泡闭锁的机制研究
摘要：本实验以豚鼠为研究对象，通过苏木精-伊红染色（HE染色）和免疫组织化学的方法对基质金属蛋白酶家族(MMPs)的MMP-2和MMP-9在卵巢上进行观察和定位，旨在为了解MMP-2和MMP-9在卵泡闭锁过程中的作用提供证据资料，从而为了解豚鼠的卵巢生殖生物学提供帮助。结果表明：MMP-2在闭锁卵泡内的颗粒细胞、卵巢基质和卵泡膜中表达；MMP-9在闭锁卵泡内的颗粒细胞、卵巢基质和卵泡膜中表达。我们的研究表明MMP-2和MMP-9在卵巢相同位置中有相同的特异性表达模式，暗示参与大致相同的卵泡闭锁功能调控。
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关键字:豚鼠；MMP-2；MMP-9；卵泡闭锁；HE染色；免疫组织化学
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words 3
引言 3
1材料与方法 4
1.1实验动物4
1.2药物和试剂4
1.3主要仪器 4
1.4 实验方法5
1.4.1石蜡切片制作 5
1.4.2 HE染色 5
1.4.3免疫组织化学 6
2结果 6
2.1 HE染色 6
2.2 MMP-2实验组和对照组 7
2.3MMP-9实验组和对照组 8
3讨论 9
3.1 MMP-2、9 9
3.2豚鼠卵泡的发育及闭锁 9
4结论 10
致谢 10
参考文献11
MMPs参与豚鼠卵泡闭锁的机制研究
引言
MMPs是一类生物活性依赖于锌离子，有降解细胞外基质(extrix matrix, ECM)能力的类肽酶家族。自从1962 年Gross 等发现第一种间质胶原酶并命名为MMP-1 后，MMP 家族目前发现的23种MMPs，根据作用底物不同可分为5种：胶原酶(MMP-1,8,13,18)、明胶酶(MMP-2,9)、基质酶（MMP-3,10,11）、膜型MMPs(MT1,2,3-MMP)和其它型(MMP-7,12,19,20,26)。而从结构和功能上，MMPs 家族主要有以下特点：（1）MMPs 的活化主要依赖活性中心的锌离子（2）MMPs 通常以酶原形式分泌，可以被蛋白酶或有机汞活化激活（3）隶属于钙依赖性中性蛋白酶家族（4）所有MMPs 都有共同的结构，即氨基末端的 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
前肽序列，可被裂解实现酶活性激活MMPs（5）基质金属蛋白酶的抑制可以抑制MMPs 活性。MMPs的组织型抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs)通过和高度保守的锌结合位点结合而特异性抑制MMPs的活性，共同调节基质代谢[1]。四种TIMPS中TIMP-1,2,4以可溶性形态分泌，而TIMP-3与ECM协同发挥作用。TIMP-1,2可抑制所用种类MMPs的活性。MMPs参与了细胞迁移、细胞增殖、凋亡和组织形态发生的过程，而卵巢的基本特性就是分泌激素和排卵，由此需要动态的、广泛的和周期性的组织再造。因此认为MMPs参与了卵巢周期卵泡发育、排卵、黄体的形成和退化的过程。在人类医学方面, 多囊卵巢综合征(polyeystieovarysyndrome, PCOS)是最常见的一种内分泌疾病,在育龄期妇女人群中发病率约6-10%[2-3]。PCOS患者卵巢组织重建可能和正常人不一样，PCOS 患者体内LH 释放频率加快振幅增大，LH分泌量非正常的增高使得体内MMP-2、9活性增加。所以PCOS患者血清MMP-2、9的水平高于正常女性[4-6]。PCOS病因和病理机制至今尚未完全阐明,因此研究MMPs对于调控卵巢周期的作用机制对阐明PCOS的病理机制有着重要的意义。
豚鼠（Guinea Pig）属哺乳纲（Mammalia）、啮齿目（Rodentia）、豪猪亚目（Hystricomorpha）、豚鼠科（Caviidae）、豚鼠属（Cavia）。身形短粗、头圆大、耳朵和四肢短小、尾巴只有残迹，眼睛明亮，耳壳薄而血管鲜红明显，上唇分裂。前足有四趾，后足有三趾，每趾都有突起的大趾甲，脚形似豚，体长225～355mm。被毛紧贴体表，毛色有白色、黑色、棕色、灰色、淡黄色和杏黄色等，其毛色组成有单毛色、两毛色和三毛色。
豚鼠妊娠期平均68天，比其它啮齿类动物长得多，青年豚鼠妊娠期有延长的趋势。由于豚鼠妊娠期长，新生仔鼠出生后即能活动，全身覆有被毛，有门齿，眼耳已张开，数小时后即能采食软料[7-8]。生长发育较快，在出生后两个月内平均每天增重4～5g。一般母鼠在分娩2～3小时后，出现一次产后发情，此时交配妊娠率可达80％。雌性豚鼠具有无孔的阴道闭合膜，发情时张开，非发情时闭合。卵巢呈囊圆形，位于肾脏下方。子宫有两个完全分开的子宫角，连接输卵管末端。子宫角会合后形成子宫颈，开口于阴道。
豚鼠性情温顺，从来不主动攻击人，可以方便地进行注射、采血和手术。与大型家畜相比豚鼠个体小，容易饲养和操作，和常用做实验的大鼠和小鼠相比，还具有较长的发情周期（15-17天）和较少的排卵数（平均3-8个），所以其卵巢容易通过连续切片观察，也便于卵巢动态发育和闭锁动态变化的观察[9]。在畜牧业生产中，动物的排卵数是重要的繁殖性状，家畜的各种繁殖疾病均与卵巢的观察，而一些家畜往往由于体型较大，发情周期短，妊娠期长且不易饲养等缺点导致研究进程缓慢，所以豚鼠是研究家畜繁殖性能理想的模型。
本实验以性成熟且正常发情的雌性豚鼠卵巢作为实验材料，通过苏木精-伊红染色（HE染色）和免疫组织化学的方法，对MMP-2、9参与豚鼠卵泡闭锁的机制进行测定和观察。
1 材料与方法
1．1 材料
正常发情周期豚鼠，购于南京市青龙山实验动物公司。豚鼠麻醉致 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
死后迅速分离卵巢，并在4%多聚甲醛中固定24h。常规石蜡组织切片，进行HE染色和免疫组化检测。
1．2 试剂
MMP-2(Lot:SC-8835)、MMP-9（Lot:SC-6840）购自Santa Cruz.，免疫组织化学试剂盒（SABC方法）购自 Boshide Co.（Wuhan, Hubei. PR China, lot: SA1021），DAB 购自Sigma Chemical Co.（St. Louis, MO, USA）。其余试剂均为国产分析纯。
1．3 仪器
全自动生物组织包埋机（浙江省金华市医疗设备厂），石蜡切片机（Leica RM2235），展片机（浙江省金华市科迪仪器设备厂），烘片机（Leica HI1220），脱色摇床（南京大学 TY-80S），光学显微镜（Nikon YS100），微波炉（格兰仕）。
1.4实验方法
1.4.1 石蜡切片的制作
1.4.1.1 样品采集
处死豚鼠，分离新鲜的卵巢，用PBS清洗后放入4%多聚甲醛中固定24h。
1.4.1.2样品处理：
（1）脱水
70%酒精1 h®90%酒精1 h®95%酒精1 h®100%酒精I30 min ®100%酒精 II 60min®100%酒精 III60 min
（2）透明
纯酒精/二甲苯混合液30 min®二甲苯I 30 min®二甲苯II 20 min®二甲苯III 20 min
（3）透蜡
二甲苯/石蜡混合液30 min®纯蜡I 30 min®纯蜡II 真空过夜®纯蜡III 60 min
（4）包埋
将预先融化好的石蜡注入金属框，待底面石蜡稍微凝固时，用温镊子夹取卵巢组织块放入金属框的中央，待稍凝，放入预备好的标签纸，自然冷却，待石蜡全部变硬后即取出，剥出蜡块。
（5）切片
将修好的蜡块进行切片，厚度为5~10 mm。切好的切片在38 ℃水浴锅中展片后用APES处理的载玻片捞起。38 ℃烤片12h后，放于切片盒以备染色。
原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/12957.html
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