摘要：为了探究60Co辐射对丽蚜小蜂死亡率及其体内Wolbachia的影响。将当天羽化的丽蚜小蜂放入平底玻璃管内，设置5个处理组，每个处理组30头0天羽化的丽蚜小蜂成虫，分别用60、80、100 Gy的60Co射线辐射处理，设置对照。然后将不同处理组的丽蚜小蜂培养在指形管中，用10%蔗糖水饲喂，每24h观察一次，统计14天中丽蚜小蜂成虫死亡率，每个处理组收集9头丽蚜小蜂，用DNA提取试剂盒法提取DNA，依据Wolbachia 的wsp 基因设计引物，用PCR扩增反应，在凝胶成像系统下观察并拍照记录结果。60Co辐射剂量与丽蚜小蜂死亡率成正比，且无法去除丽蚜小蜂体内的Wolbachia。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 供试材料2
1.1.1 供试虫源2
1.1.2 辐射源2
1.2 试验方法2
2 结果与分析3
2.1 丽蚜小蜂体内Wolbachia3
2.2 丽蚜小蜂死亡率变化3
3 讨论4
3.1 不同剂量对丽蚜小蜂体内Wolbachia的影响4
3.2 不同剂量对丽蚜小蜂寿命的影响 4
致谢4
参考文献5
60Co辐射对丽蚜小蜂死亡率及其体内Wolbachia的影响
引言
引言
丽蚜小蜂Encarsia formosa (Gahan) 属膜翅目(Hymenoptera)蚜小蜂科（Aphelinidae），是一种孤雌生殖的寄生蜂，是粉虱的寄生性天敌。寄生在寄生生蜂内的Wolbachia会导致寄生蜂细胞进行孤雌生殖。人们主要研究丽蚜小蜂对温室白粉虱、烟粉虱和银叶粉虱的控制作用。
本文运用不同剂量60Co辐射对丽蚜小蜂进行处理，观察辐射对其死亡率的影响，并检测辐射后赤眼蜂体内Wolbachia的变化，得出合理结论。
1 材料与方法
1．1 供试材料
1．1．1 供试虫源 丽蚜小蜂为北京依科曼公司购买的商品化天敌。购买
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时为丽蚜小蜂黑蛹期，其寄主是温室白粉虱若虫。羽化后放至直径口约3.5cm、高约9.5cm指形管中，在养虫室培养。养虫室温度25±1℃，相对湿度为65%～75%，光周期16L:8D。
1．1．2 辐射源 南京航空航天大学辐照中心的60Co辐射源。
1．2 试验方法
将120头羽化0~1天的丽蚜小蜂成虫，分成3个处理组,1个对照组，每组30头成虫，3个处理组分别用60、80、100 Gy的60Co射线辐射处理，其中剂量率为2 Gy/min，对照组不进行辐射处理，每组重复试验三次。然后将处理组和对照组的丽蚜小蜂培养在指形管中，用10%蔗糖水饲喂，每24小时观察统计死亡丽蚜小蜂头数，累计计算14天中丽蚜小蜂成虫死亡率。
处理24小时后，分别在每个处理组中的收集9头丽蚜小蜂，用DNA提取试剂盒法提取DNA，用于检测Wolbachia。
DNA提取试剂盒法选用Wizard® SV Genomic DNA Purification Kit（A2360，Promega，Madison，WI）试剂盒。提取步骤如下：
配制提取DNA所需的Master Mix。Mix配制所需试剂及其提前单头丽蚜小蜂总DNA的用量如下表所示
Master Mix配制体系
Master Mix System
试剂
用量（单位：μL）
Nuclei Lysis Solution
200
0.5M EDTA (PH8.0)
50
Proteinase K (20mg/ml)
20
RNase A Solution (4mg/ml)
5
总体积
275
将单头丽蚜小蜂挑入1.5mL的离心管中，加入50 μL Master Mix，用灭菌的一次性塑料碾槌对虫体充分研磨碎。
加入225 μL Mix，冲洗研磨棒。离心管涡旋混匀，并简单离心，放入55 ℃水浴锅孵育1618小时。
往单个离心管中加入250 μL的Wizard® SV Lysis Buffer，涡旋混匀，放入离心机，以13000 g的转速离心5 min。
将单个离心管上清液转入单个Wizard® SV Minicolumn Assembly集合装置中。
将装置放入离心机，以13000 g的转速离心3 min，使得DNA可以集合到Minicolumn柱子上。
将Minicolumn从集合装置上取下，倒弃Collection Tube中的液体，并将Minicolumn重新放入装置中。
往单个装置中加入650 μL的Wizard® SV Wash Solution，放入离心机，以13000 g的转速离心1 min，倒弃Collection Tube中的液体，重复此步骤，共洗脱4次。
将倒弃Collection Tube中液体的装置放入离心机，以13000的转速离心2 min，使Minicolumn干燥。
将Minicolumn 转移到一个新的1.5 mL离心管中，室温放置10 min。
往Minicolumn中加入65 ℃ 70 mL的NucleaseFree Water。室温放置2 min。
将Minicolumn和离心管的装置放入离心机中，以13000 g的转速离心1 min。
将Minicolumn移走，离心管中的液体就为所提取的DNA，可以立即使用或置于20 ℃长期保存。
依据Wolbachia 的wsp 基因设计引物：上游引物81F: 5TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC3;下游引物691R: 5AAAAATTAAACGCTACTCCA3。PCR 扩增反应参照陆明红等( 2011) 方法。PCR扩增体系为25 μL，包括14．25 μL ddH2O、2．5 μL10 × Buffer、2．5 μL MgCl2、2．5 μL dNTPs、上游和下游引物各0．5 μL、0．25 μL 的Taq DNA 聚合酶、2 μL 模板。扩增条件： 94℃预变性3 min，94℃变性30 s； 55℃复性45 s，72℃延伸1 min，共35 个循环； 最后72℃ 延伸7 min。

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