【目的】本研究通过对水稻响应赤霉素的小RNA进行鉴定与分析，构建了由小RNA、靶基因、生物学功能组成的基因表达调控GRN网络图，为阐明小RNA在水稻赤霉素信号通路中的调控作用奠定了基础。【方法】通过对赤霉素处理水稻幼苗的小RNA测序数据分析，鉴定水稻中与赤霉素相关的小RNA，并利用miRDeep-P软件包预测新microRNA，通过借助降解组测序数据对预测结果进行验证，最后进行GO和通路分析并构建出GRN网络图。【结果】鉴定得到483个已知miRNA(miRBase21.0)和305个新miRNA；通过差异表达分析、靶基因预测及降解组验证发现空白对照与赤霉素处理之间16个差异表达microRNA和6条差异表达小RNA及对应的51个靶基因，空白对照与赤霉素抑制剂多效唑处理之间23个差异表达microRNA和8条差异表达小RNA及对应的71个靶基因；靶基因分别富集到8个和30个显著的GO term(agriGO, FDR<0.05),其中4个已经注释为与赤霉素相关；构建了两幅分别含有36个节点、80条边和105个节点、730条边的网络图。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1材料4
1.2方法4
1.2.1赤霉素处理4
1.2.2总RNA的提取与质量检测5
1.2.3 small RNA提取与胶回收5
1.2.4 small RNA的cDNA文库构建与测序6
1.2.5测序数据处理与生物信息学分析6
1.2.6预测新的miRNA7
1.2.7降解组测序验证法7
1.2.8靶基因相关GO term和通路分析8
1.2.9 small RNA与靶基因的互作网络构建9
2结果与分析9
2.1 small RNAseq 原始数据质控10
2.2全基因组比对结果10
2.3新miRNA预测结果11
2.4 miRNA差异表达分析11
2.5靶基因预测结果12
2.6其他sRNA响应 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
赤霉素的信息挖掘12
2.7降解组数据验证分析13
2.8生物学功能预测13
2.9 sRNAGeneFunction互作网络图15
3讨论 16
3.1基于 small RNAseq挖掘响应赤霉素的关键 miRNA16
3.2利用降解组测序技术验证预测结果17
3.3基于验证结果预测生物学功能及互作网络构建17
致谢18
参考文献18
水稻响应赤霉素的小RNA鉴定与分析
引言
小分子RNA（small RNA, sRNA）是指一类约由1924个核苷酸组成的非编码RNA，自1993年问世以来已经被多次证实为重要的生物调节因子[1]，根据其形成机制、结合效应蛋白和生物学功能的差异被分为microRNA（miRNA）、small interfering RNA（siRNA）和piwiassociated RNA（piRNA）三种[2]，其中piRNA仅在人体和动物中出现，miRNA和siRNA对植物的生长发育影响较大。MiRNA是一类长约2024个核苷酸，具有调控功能的内源性非编码RNA，据估计高等真核生物中30 %的基因受到 miRNA 调控[11]，一般地，植物的miRNA通过与靶基因mRNA进行碱基互补配对切割靶位点，从而实现调控靶基因表达的功能。目前主要通过small RNAseq来研究小分子RNA，采用最多的是Illumina公司的Solexa高通量测序技术，包括了HiSeqTM 2000和Genome Analyzer II x (GA II x)等平台，这些测序平台可一次性获得数百万条small RNA序列，快速全面地鉴定某组织在特定状态下的所有small RNA，为small RNA功能研究提供高效服务。
赤霉素(gibberellins, GAs)是植物体内重要的植物激素，主要通过促进细胞分裂来促使植物生长发育及其不同生长时期的转化，在调控种子休眠到发芽、从幼苗到成年植株以及营养生长到生殖生长的转化等生长发育阶段发挥着显著作用。赤霉素的信号通路主要由赤霉素、赤霉素受体、DELLA蛋白和介导DELLA蛋白降解的调控因子等组成，DELLA蛋白是一类在赤霉素信号转导中起显著阻遏作用的物质。在水稻中已经发现SLR1(SLENDER RICE1) 蛋白——一种DELLA蛋白，能够显著抑制赤霉素信号通路中下游的基因表达，其中就包括了GAMYB，该基因编码促进赤霉素应答基因的转录因子。目前有研究表明，参与赤霉素信号调控的miRNA包括了miR156、miR159、miR319、miR396等。Yu 等[3]研究发现许多DELLA蛋白能够直接结合miR156的靶标——SPL蛋白的转录因子，并且抑制其活性；他通过实验证明了在长日照条件下，由GAs介导的DELLA蛋白降解使得SPL介导激活了miR172和成花基因的表达，从而促进了开花，由此表明了miR156通过调控SPL蛋白活性参与GAs介导的成花发育过程。而miR159广泛参与到调控植物的叶片、花器官建成以及种子成熟等多个过程，研究发现这主要是因为miR159能够直接清除编码GAs合成和转导过程中特有的转录调控因子——GAMYB相关蛋白（MYB33，MYB65，MYB101）[4]。这些参与调控赤霉素信号通路的miRNA还存在一个共同点——同时受到其他激素的调控作用，实际上小RNA参与植物激素的调控网络十分复杂，更进一步的研究有待开展。
虽然对于水稻生长发育相关miRNA的研究工作已经开展了许多，但是针对赤霉素的还相对较少。截止到目前miRBase数据库(http://www.mirbase.org/)中共有水稻713条miRNA成熟序列以及592条前体序列被收录[15]，而研究的热点多围绕在osamiR156、osamiR160和osamiR397等与水稻多个生长发育过程有显著联系的miRNA，其他miRNA方面的研究有待完善。因此本研究以赤霉素为切入点，对水稻响应赤霉素的small RNA进行鉴定与分析，为阐明small RNA对赤霉素信号通路的调节机制打下研究基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 供试材料

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