:CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌为防止外源生物的入侵，维持自身遗传信息的完整，在自体内产生的一种免疫防卫机制,特别是为细菌和古菌抵御外源可移动DNA片断的入侵提供了有效的防卫。黄单胞水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzae, Xoo）具有I型CRISPR-Cas系统，它引起的白叶枯病是一种最具破坏性的水稻细菌病害。根据基因组测序分析，低毒力黄单胞菌株OS198与正常毒力菌株PXO99A的CRISPR-Cas系统存在一些特殊的差异。为了研究黄单胞的毒力与其CRISPR-Cas系统间的关系，本研究采用同源重组的方法构建了CRISPR-Cas的缺失突变菌株PXO99AΔCRISPR，并获得了OS198的CRISPR-Cas系统的异源互补子PXO99AΔCRISPR/#454。将CRISPR-Cas的缺失突变菌株、异源互补子及PXO99A野生型分别接种水稻，两周后发现它们在水稻上形成的病斑长度无显著性差异，表明CRISPR-Cas系统对 PXO99A病菌的毒力没有影响。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法4
1.1供试菌株、植物材料和试剂4
1.1.1 菌株及质粒4
1.1.2 植物材料4
1.1.3试剂4
1.1.4 抗生素5
1.2.1 培养基的配置5
1.2.2培养条件5
1.2.3 引物设计与合成5
1.3 OS198 CRISPRCas克隆的筛选5
1.4 PXO99A CRISPRCas缺失突变体的构建6
1.4.1敲除载体pKMCRISPRPXO99A的转化6
1.4.2 水稻黄单胞感受态的制备7
1.5水稻黄单胞的转化法 8
1.6菌落PCR验证 8
1.7 PXO99A CRISPRCas缺失异源互补子的构建8
1.8水稻剪叶接种9
2 结果与分析9
2.1 OS198基因文库筛选含有CRISPRCas系统的质粒9
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2.2 PXO99ACRISPRCas缺失突变体的构建10
2.3 PXO99A CRISPRCas缺失异源互补子的构建10
2.4水稻剪叶接种测试PXO99A CRISPRCas缺失突变体及异源互补子的毒力11
3 讨论12
3.1 突变体菌株的构建13
3.2 CRISPRCas系统对菌株毒力的影响13
致谢14
参考文献15
CRISPRCas系统对水稻白叶枯病菌PXO99A毒力影响的探究
植物保护 薛兰
引言
引言: 细菌和古细菌为防止外源生物的入侵，维持自身遗传信息的完整，在自体内产生了许多免疫防卫机制，CRISPRCas系统即为其中一种,它为细菌和古细菌抵御外源可移动DNA片断(噬菌体，质粒，转座原件等)的入侵提供了有效的防卫。CRISPR 全名为成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) ，CRISPR 位点包含多个重复序列，长度一般为2050bp，重复序列间插有间隔区域，间隔区域与外源DNA 片段匹配[1]。在CRISPR 位点的上游定位有CRISPR 前导序列, 其功能作为启动子。Cas全称为CRISPR相关蛋白(CRISPRassociated proteins)，Cas 基因编码多种Cas蛋白，它们分别有具有核酸酶、解旋酶、聚合酶和RNA 结合蛋白等功能[2]。
CRISPRCas系统在细菌体内发挥免疫功能主要分三个阶段。第一阶段是间隔序列的获得，第二阶段是CRIPSR 基因簇的表达与crRNA的成熟，第三阶段是CRISPRCas系统对外源遗传物质的切割。在第一阶段，细菌将入侵的噬菌体或质粒的DNA片断整合到自身基因组的重复序列之间，即间隔区域的获得；在第二阶段，CRISPR基因被转录成前体crRNA（precrRNA，precursor crRNA)[3]，在Cas 蛋白的帮助下，前体crRNA被剪切为成熟的crRNA；在第三阶段，成熟的tracrRNA、crRNA和Cas基因形成核糖核蛋白复合物，crRNA识别外源匹配的DNA序列并与之结合，从而介导核糖核蛋白复合物对外源遗传物质的切割[4]。
目前对CRISPRCas系统的功能研究主要分三个方面: 一是CRISPRCas系统可保护原核生物抵御外源DNA的侵入，二是CRISPRCas系统可调控细菌内源基因表达[5]，三是Ⅱ型CRISPRCas系统可作为新型基因编辑的工具[6]。而有关于CRISPRCas 系统在病原细菌致病性方面的研究则比较少。CRISPR可以使细菌对外源基因产生获得性免疫，该过程中获得的新间隔序列可能导致细菌毒力的改变。噬菌体感染是细菌获得毒力和致病性的重要方式，棒状杆菌（Corynebacterium）、肉毒梭菌（Clostridium botulinum）、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、链球菌（Streptococcus）和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )等细菌均含有编码毒力因子的温和噬菌体基因，这一方面说明细菌中的CRISPRCas系统可以通过抵御毒性噬菌体来干扰毒力因子在致病菌间的传播，另一方面说明CRISPRCas系统为病原菌提供了基因水平上的感染能力。一项关于粪肠球菌（Enterococcus faecalis）CRISPRCas 系统的研究显示，前期，具备CRISPRCas 系统的粪肠球菌的比敲除Type II CRISPRCas 系统的粪肠球菌的毒力弱50%，随着接种时间增长和接种量的增加，具备II 型CRISPRCas 系统的粪肠球菌更迅速且更具杀伤性地杀死了小鼠[7]。CRISPRCas系统对病原菌的致病性影响并不是简单的增强或抑制效应，涉及它们之间的关系有待进一步研究证实[8]。
相比之下，CRISPRCas系统对植物病原菌毒力的影响的研究则较少。一项关于黄单胞水稻致病变种群基因组的研究比较了白叶枯病菌的三个亚种(PXO99A，KACC10331 及MAFF311018)的CRISPR 位点结构[9]。由于CRISPR 位点中的间隔序列随菌株的进化而更新，因而比较PXO99A、KACC10331 和MAFF311018的CRISPR 位点组成可了解三个菌株间的亲缘关系。间隔序列按时间顺序插入并排列，比较显示三个菌株拥有五个相同的插入序列(PXO99A中的S1,S2,S3,S4,S5, KACC中和MAFF中的S1,S2,S3,S5,S6)，且PXO99A与KACC有更多亲缘相近的间隔序列，然而MAFF自S6后拥有更多与另外两个菌株不同的新的间隔序列。由此推测PXO99A与KACC间的亲缘关系更近，极可能MAFF在进化过程中丢失了许多老的间隔序列，取而代之的，携带更多新的外源间隔序列。上述研究借助CRISPRCas间隔序列比较了不同Xoo菌株间的亲缘关系，显示出了CRISPRCas间隔序列与Xoo的遗传进化具有一致性。

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