本试验以若干株猪肠道致病性大肠杆菌为宿主菌，使用双层琼脂平板法从滁州一猪肠粪样中分离噬菌体。结果分离得到一株可感染产至贺毒素大肠杆菌（STEC W3）并裂解两株产肠毒素大肠杆菌（ETEC 104、 ETEC K88）、一株肠道致病性大肠杆菌（EPEC 143）和一株产至贺毒素大肠杆菌（STEC W5）的烈性噬菌体，命名为大肠杆菌噬菌体C6（Escherichia Coli phage C6）。电镜结果显示C6为T4样噬菌体，并且该噬菌体在30℃-50℃、pH值为3-12时较为稳定。噬菌体C6在STEC W3上的最佳感染复数10，潜伏期75 min，170 min到达爆发期。噬菌体C6在液体培养基中对五株致病性大肠杆菌均有抑菌效果。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1.材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株与噬菌体 2
1.1.2 仪器 2
1.1.3 主要试剂与培养基 2
1.2 噬菌体分离纯化 2
1.3 噬菌体鉴定 3
1.3.1 噬菌体全基因组测序 3
1.3.2 噬菌体透射电镜观察 3
1.3.3 点滴法测定宿主谱 3
1.4 噬菌体生物学特性分析 3
1.4.1测定噬菌体耐热性 3
1.4.2 测定噬菌体耐酸碱性 3
1.4.3 测定噬菌体最佳感染复数 3
1.4.4测定一步生长曲线 3
1.4.5测定抑菌效力 4
2.结果与分析 4
2.1 噬菌体分离纯化 4
2.2噬菌体鉴定 4
2.2.1噬菌体酶切鉴定 4
2.2.2噬菌体全基因组测序 4
2.2.3噬菌体透射电镜结果 5
2.2.4 噬菌体的宿主谱 5
2.3 噬菌体的生物学特性分析 5
2.3.1耐热性测定 5
2.3.2耐酸碱性测定 5
2.3.3最佳感染复数测定 6
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2.3.4一步生长曲线测定 6
2.3.5抑菌效力测定 6
3．讨论 8
3.1 噬菌体C6的宿主范围 8
3.2 噬菌体C6的生物学特性 8
3.3 噬菌体C6在肠道中的作用 8
致谢 9
参考文献 9
一株猪肠道致病性大肠杆菌烈性噬菌体的分离及其 生物学特性分析
引言
大量微生物存在于动物肠道内，总体上这些微生物与宿主机体在营养代谢、免疫调节和基因分子水平都存在共生关系[1]。大肠杆菌是肠道中的常见菌，在动物出生后不久就存在于幼儿的消化道内，其在消化道内可以帮助动物机体消化食物，有利于营养成分的吸收和利用[2]，但大肠杆菌中也存在着可以致病的亚型，可以引起一些消化道疾病。对于猪养殖产业来说，仔猪腹泻是非常常见的肠道疾病，多存在于养殖环境差的猪场，该病会影响营养的消化吸收，影响到仔猪的生长，严重时可引起仔猪死亡，给猪养殖业带来巨大的经济损失。常常引起仔猪腹泻的细菌就是大肠杆菌，其中主要为肠道产毒素性大肠杆菌（ETEC）,除此之外，肠道致病性大肠杆菌（EPEC）和肠产志贺毒素大肠杆菌（STEC）也常常引发仔猪腹泻[3]。2020年是饲用抗生素命运的转折之年，饲用抗生素的使用将被限制并直至全面禁止[4]，在饲料中添加抗生素来减少仔猪患腹泻病的方法已难以为继，必须寻找新的方法解决仔猪腹泻问题，自然界中就存在的噬菌体有望成为抗生素的有效替代品。
噬菌体可在宿主菌体内大量繁殖，最终引起宿主裂解死亡。噬菌体用来治疗由细菌感染引起的疾病的方法称为噬菌体疗法[5]。噬菌体疗法曾因抗生素良好的治疗效果而受到冷遇，但随着抗生素滥用所带来的问题日渐严重，噬菌体重新获得人们的重视[6]。噬菌体广泛存在于环境中，理论上讲，微生物富集的地方都有其相对应的噬菌体，噬菌体可以通过分离鉴定的方法获取[7]。目前，噬菌体在动物病原菌感染方面的防控研究已较多，预先接种噬菌体能够有效缓解病原菌感染的症状，说明噬菌体防控有较好的效果。Lee等提前一周在日粮中添加ETEC噬菌体，与未添加噬菌体的的对照组相比，断奶仔猪攻毒后的平均日增重增加，粪样评分改善，血清中Thfα浓度和结肠食糜中pH降低[8]。本研究使用若干株ETEC、EPEC和STEC来分离猪肠道中的噬菌体，选取其中一株烈性噬菌体，并测定其生物学特性，为使用该株噬菌体治疗大肠杆菌感染所引起的仔猪腹泻提供理论依据。
1.材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与噬菌体
本试验用于噬菌体分离的样品为本实验室前期从猪肠道样品中分离得到。用于分离噬菌体的致病性大肠杆菌为本实验室分离得到，包括产肠毒素大肠杆菌（ETEC），肠致病性大肠杆菌（EPEC），产至贺毒素大肠杆菌（STEC），具体信息列于表1。
本试验中的猪肠道噬菌体样品采集自江苏安徽滁州一猪场断奶仔猪粪样，共采集得到10份样品。
1.1.2 仪器与耗材
本试验用到的主要仪器中的台式高速冷冻离心机来自Kendro公司，涡旋振荡器来自Scientific Industries，台式恒温振荡器来自Crystal 公司，生物洁净工作台来自苏州安泰空气技术有限公司，高温灭菌器来自KAGOSHIMA SEISAKUSYO LSC，隔水式电热恒温培养箱来自上海市跃进医疗器械一厂，微量紫外分光光度来自Thermo，电子天平来自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。
本试验用到的耗材主要有一次性培养皿、0.22 μm针式微孔过滤器、20 mL一次性注射器和离心管。
1.1.3 主要试剂与培养基
（1）液体LB培养基：10 g氯化钠、10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物，加去离子水至1 L，放置于高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌处理后使用。
（2）半固体LB培养基：10 g氯化钠、10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、7.5 g琼脂粉，加去离子水至1 L，放置于高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌处理后使用。
（3）固体LB培养基：10 g氯化钠、10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、15 g琼脂粉，加去离子水至1 L，放置于高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌处理后使用。

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