解淀粉芽孢杆菌SQR9是根际促生菌，它分离于黄瓜种植发病区中健康植株的根际。在黄瓜根际能抑制尖孢镰刀菌生长。研究结果表明SQR9能高效定殖在黄瓜根际保护植株不受病原菌的侵染。解淀粉芽孢杆菌在MSNc培养基中的成膜能力显著高于解淀粉芽孢杆菌FZB42、枯草芽孢杆菌3610、和枯草芽孢杆菌168。经研究分析表明，黄瓜根系细胞中的提取物以及从黄瓜根系分泌出的一些物质都具有诱导作用。在几组突变体中，突变体∆degU无法感知根系分泌物，突变体∆spo0A和∆sinI不能感知根系细胞提取物，而将突变体∆degU和∆spo0A混合培养时，其对根系细胞提取物和黄瓜根系分泌物的响应得以恢复，生物膜调控蛋白DegU得以成功地异源表达。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 SQR9突变体的GFP标记2
1.2.2 黄瓜植株根系分泌物和根提取物的收集2
1.2.3 SQR9及其突变体的生物膜形成的定性观察和定量分析3
1.2.4 SQR9及其突变体根际定殖观察3
1.2.5 调控蛋白DegU的异源表达和纯化3
1.2.6 数据统计分析4
2 结果与分析5
2.1 SQR9和几种芽孢杆菌模式菌的生物膜形成能力比较5
2.2 SQR9在黄瓜根表的定殖观5
2.3 黄瓜根系细胞提取物和根系分泌物对SQR9生物膜形成的影响5
2.4不同突变体在形成生物膜时对黄瓜根系分泌物和根系细胞提取物的响应6
2.5 黄瓜根系中的多糖成分对SQR9生物膜形成的影响7
2.6 SQR9生物膜形成对植物细胞多糖的响应7
2.7 SQR9不同突变体的生长比较8
2.8 SQR9不同突变体黄瓜根际定殖能力比较8
2.9 SQR9生物膜调控蛋白DegU的表达纯化9
3 讨论10
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致谢11
参考文献12
黄瓜根际信号因子对解淀粉芽孢杆菌SQR9根表定殖的影响研究
环境科学 文端
引言
引言 植物根际（rhizosphere）是一种极为特殊的生态环境，在植物根际区域存活的微生物有如下特点：种类多，数量大，代谢旺。而PGPR在发挥生防与促生作用时的重要前提就是在植物根际的定殖是否有效。一方面，PGPR为植物根系提供养分及促进植物营养吸收，抵御土传病原菌对植物侵染，降解正在进入根际和根系的污染物；另一方面，PGPR利用植物根系分泌物作为营养进行大量生长繁殖，并通过自身的代谢对根际土壤和根系产生影响。研究表明，只有当PGPR聚集（成膜）到一定程度，才能发挥PGPR的群体效益和功能[5][6]。在实验室条件下，微生物的生物膜形成能力与微生物在植物根表面的成膜能力和根际环境中的定殖能力有密切的联系，但根际环境更为复杂，环境因子对芽孢杆菌中生物膜调控因子影响的报道较少[10]。本研究通过基因敲除，结合GFP标记的方法，研究了SQR9不同突变体在黄瓜根表定殖的差异，试图阐述SQR9根际定殖机理。
1 材料与方法
1．1 材料
供试菌株：E. coli Top10，E. coli BL21，B. amyloliquefaciens SQR9，SQR9gfp（带有质粒pHAPⅡ的SQR9），SQR9kz（带有质粒pXKZ的SQR9），该菌株由本实验室成功构建并保存。由大学生命科学学院提供的枯草芽孢杆菌标准菌168；枯草芽孢杆菌3610；解淀粉芽孢杆菌FZB42。突变株△spo0A、△degU和△（spo0A+degU）由本实验室构建和保存。
质粒：pXKZ带有由木糖诱导型启动子（PxylA）控制下表达的comK基因和零霉素（Zeo）抗性基因；pNW33N，氯霉素（Cm）抗性；pMD19T，氨苄青霉素（Amp）抗性；pET29α（+），卡纳（Kan）抗性，大肠杆菌表达载体；pHAPⅡ，卡纳（Kan）抗性，大肠杆菌芽孢杆菌穿梭载体（带有GFP荧光蛋白）。
供试作物：黄瓜，品种为津春4号。
抗生素：Ampicillin，Kanamycin，Zeocin和Chloromycetin自北京鼎国生物技术有限责任公司。
试剂：PrimeSTAR HS DNA Polymerase、rTaq酶、Solution Ⅰ连接酶、限制性内切酶、DNA Marker均购自宝生生物技术有限公司（TaKaRa）。
供试培养基：1、LB培养基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 L，pH7.0。2、MSNc培养基：磷酸钾缓冲液5 mM pH 7.0，MOPS溶液100 mM pH 7.0，氯化镁2 mM，氯化钙700 mM，氯化锰50 mM，氯化锌1 μM，硫胺素2 μM，0.2%氯化铵，0.5%纤维二糖(Beauregard et al., 2013)，用于菌体生物膜的培养。
1.2 方法
1.2.1 SQR9突变体的GFP标记
为了将质粒pXKZ消除，在带有pXKZ质粒的突变菌株中植入特殊带有GFP荧光蛋白的芽孢杆菌大肠杆菌穿梭载体。
1.2.2 黄瓜植株的根部提取物和根系分泌物的采集
黄瓜根系分泌物收集：在2%浓度的次氯酸钠溶液浸泡黄瓜种子，维持3 min，再用无菌水冲刷种子3次，再把种子均匀放置在垫有潮湿滤纸的9 cm培养皿中30℃催芽。种子萌发后将其移入含有50 ml 1/2浓度的Hoagland营养液的50 ml三角瓶中，在相同条件下培养3天。取出黄瓜苗，用去离子水洗净根上的残留培养液，然后将每棵幼苗放入一个盛有50 ml,去离子水的三角瓶里，完全浸没根系，每种作物采集20棵幼苗的根系分泌物。将三角瓶放入光照培养箱中28℃培养24 h，日光照16 h，然后取出植株苗。将1000 ml的收集液抽滤除去根系碎片，冷冻干燥后溶于20 ml超纯水，于70 °C保存待用。
黄瓜根提取物收集：根系分泌物所用的黄瓜苗取出后，选10棵黄瓜的根系，分别剪取1 g，在液氮中充分研磨后加入4 ml水溶，将样品混合后过0.45 µm的无菌滤膜，冷冻干燥后溶于2 ml超纯水，于70℃保存待用。
1.2.3 SQR9及其突变体成膜的定量分析和定性观察
在LB培养基上接种活化后的菌株，37℃，170 rpm培养到对数中期（OD600=1.0），将发酵液离心，然后重新悬浮在等体积的MSNc培养基中。生物膜试验用48孔细胞培养板进行（鼎国，北京），外围的24孔加无菌的培养基作保护，中间的24孔每孔加上2 ml MSNc培养基，接种10 µl上述重悬的菌悬液。添加根系分泌物时，使终浓度达到初始收集时的浓度（每孔20 μl）；添加根提取物时，每孔加10 µl浓缩提取物；添加植物多糖时，使终浓度为0.5%。生物膜的定量分析采用称重法[1]。

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