目录
摘要 I
关键词 I
ABSTRACT I
KEY WORDS II
引言 2
1 材料与方法 2
1. 1 材料与试剂 2
1. 1. 1 主要试剂 2
1. 1. 2 质粒和菌种 2
1. 1. 3 仪器与设备 2
1. 2 方法 2
1. 2. 1 枯草芽孢杆菌Ffh基因的克隆 2
1. 2. 2 重组表达载体 pet28a(+)Ffh的构建 3
1. 2. 3 BL21（DE3）感受态细胞的制备 3
1. 2. 4 重组质粒转化感受态细胞 4
1. 2. 5 重组质粒的鉴定 4
1. 2. 6 IPTG诱导pet28a(+)Ffh重组蛋白的表达 4
1. 2. 7 重组蛋白Ffh的纯化 5
1. 2. 8 SDS—PAGE凝胶电泳检测 5
2 结果与分析 6
2. 1 Ffh基因的克隆 6
2. 2 质粒的酶切 6
2. 3 重组质粒pet28a(+)Ffh的构建 6
2. 4 阳性克隆子菌液测序验证及重组质粒序列对比 7
2. 5 重组蛋白Ffh的表达鉴定及表达产物SDSPAGE分析 7
2. 6 重组质粒pet28a(+)Ffh表达产物的纯化 7
3 讨论 8
3. 1 感受态细胞的选择对重组质粒的影响 8
3. 2 重组蛋白是否表达 8
3. 3 本底表达 9
3. 4 重组蛋白的表达形式 9
3. 5 IPTG诱导条件的调整 9
3. 6 纯化过程中的各种因素 10
3. 6. 1 组氨酸标签 10
3. 6. 2 镍柱 10
3. 6. 3 洗脱液浓度 10
3. 6. 4 其他因素 10
3. 7 其他蛋白纯化方式 11
3. 8 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳脱色 11
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参考文献： 11
枯草芽孢杆菌Ffh蛋白在大肠杆菌中的重组表达
摘要
在枯草芽孢杆菌中，迄今为止鉴定出的唯一的分泌特异性伴侣蛋白是Ffh蛋白（fiftyfour homolog），Ffh蛋白与scRNA（small cytoplasmic RNA）形成复合物，该复合物就是通常所说的信号识别颗粒。枯草芽孢杆菌作为重要的工业生产菌，其分泌产物不仅无毒而且回收纯化较为简便，但在表达并大量生产异源蛋白时仍然存在着一些技术方面的瓶颈，Ffh蛋白在大肠杆菌中重组表达后得到的纯化蛋白可以制作抗体，从而进一步了解枯草芽孢杆菌中与SRP有关的蛋白质的运输和分泌。本文利用PCR技术将枯草芽孢杆菌的Ffh基因片段进行扩增，将Ffh基因片段导入质粒pet28a(+)，同源重组构建重组表达载体pet28(+)Ffh，转化宿主细胞BL21（DE3），确保重组质粒序列与片段序列比对无误后进行重组蛋白的表达，控制温度并使用IPTG对重组蛋白进行诱导表达，将获得的重组蛋白进行组氨酸标签特异性亲和纯化。通过分析实验得到的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳结果对重组蛋白的表达形式进行分析和讨论并提出解决方法，进一步对IPTG的诱导条件、影响纯化效果的相关因素和纯化方式进行讨论。

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