：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是广泛存在于土壤和植物中的一种益生菌，可以诱导高效的肠道黏膜免疫反应。因此，应用枯草芽孢杆菌作为口服免疫抗原递送载体具备广泛的前景。禽流感是由A 型流感病毒引起的禽类烈性传染病，其频繁爆发给我国乃至世界上许多国家的养禽业造成了极大的经济损失。一方面，血凝素（Hemagglutinin ，HA）片段不仅是禽流感病毒的主要包膜糖蛋白，更是中和抗体的首要靶标。另一方面，PB1-F2 蛋白是最新发现的流感病毒表达的第 11 个蛋白，该蛋白在流感病毒感染呼吸道上皮细胞的宿主天然免疫反应中起着重要作用，可通过改变感染细胞的膜电势，促进细胞调亡。综上，本试验首先通过PCR扩增获得启动子 CRT基因、HA片段以及PB1-F2片段。在此基础上，应用Overlap技术(重叠扩增获得融合片段CRT-HA-PB1-F2片段；在此基础上通过一步定点克隆法构建枯草芽孢杆菌整合表达载体PInAmyE-CRT-HA-PB1-F2质粒和穿梭表达载体PMK3-CRT-HA-PB1-F2质粒。 本研究为制备新型枯草芽孢杆菌禽流感口服粘膜免疫疫苗奠定基础。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
1.材料与方法 4
1.1实验材料 4
1.1.1 试剂及耗材 4
1.1.2主要仪器 6
1.2 实验方法 6
1.2.1启动子CRT基因的克隆 6
1.2.2高致病性禽流感 H5N1病毒血凝素(HA)基因的克隆 6
1.2.3低致病性禽流感 H9N2病毒 PB1F2 基因的克隆 6
1.2.4串联CRT,HA和PB1F2片段 6
1.2.5扩增含有载体同源臂的片段CRTHAPB1F2 7
1.2.6pInAmyE质粒载体和PMK3质粒载体酶切反应 7
1.2.7重组串联整合表达HA和PB1F2载体质粒的构建： 7
1.2.8重组产物的PCR鉴定 8
1.2.9重组产物的酶切鉴定 8
2.结果与分析 9
2.1 CRT,HA,PB1F2片段的
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扩增 9
2.2 Overlap PCR获得CRTHA，HAPB1F2片段 9
2.4在CRTHAPB1F2两侧添加载体同源臂 11
2.5 PInAmye,PMK3载体酶切 11
2.6重组产物的PCR鉴定 11
2.7重组产物的酶切验证 12
3.讨论 13
致谢 14
参考文献 15
枯草芽孢杆菌重组串联表达 HA 和 PB1F2载体的构建

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