本研究针对产肠毒素大肠杆菌（ETEC）是引起断奶仔猪腹泻的主要病原并给我国养猪业带来巨大损失的这个问题，研究仔猪肠道大肠杆菌噬菌体的分布情况以及肠道内裂解ETEC的噬菌体的裂菌效力，为仔猪腹泻预防措施的制订提供新思路。本试验用此前实验室分离到的93株大肠杆菌为指示菌，采用双层平板法分离南京和滁州两个猪场断奶前和断奶后仔猪粪样中的大肠杆菌噬菌体，每个猪场采集非同窝断奶前和断奶后粪样各5份。我们从20份粪样中一共分离到了45株噬菌体，其中南京猪场30株，滁州猪场15株，统计两个猪场分离到的噬菌体，发现两猪场均是断奶后比断奶前粪样分离到更多的噬菌体。此外，两个猪场上均存在着一株核心噬菌体，可能对仔猪肠道健康有着重要作用。对分离到的噬菌体进行鉴定，共获得7株可裂解ETEC的噬菌体，但这7株噬菌体只能裂解ETEC不能感染ETEC，利用浊度法测定了这7株噬菌体对ETEC的抑菌效力，发现有6株对ETEC有显著的抑菌效力。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 2
1 引言 2
2 材料与方法 3
2.1 材料 3
2.1.1 仪器 3
2.1.2 试剂 3
2.1.3 耗材 3
2.1.4 菌株 3
2.2 材料的制备 3
2.2.1 液体LB培养基的制备 3
2.2.2 半固体LB培养基的制备 4
2.2.3 固体LB培养基的制备 4
2.2.4 PBS的配制 4
2.2.5 SM保存液的制备 4
2.3 试验方法 4
2.3.1 猪场采样 4
2.3.2 分离纯化噬菌体 4
2.3.3 点滴法测定裂解谱 4
2.3.4 保存大肠杆菌噬菌体 5
2.3.5 噬菌体基因组提取 5
2.3.6 酶切鉴定噬菌体 5
2.3.7 电镜观察形态 5
2.3.8 噬菌体感染谱的测定 5
2.3.9 抑菌试验 5
3 结果与分析 6
3.1 噬菌 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
体的分离与纯化 6
3.2 噬菌体的鉴定 6
3.3 裂解ETEC噬菌体裂菌效力 7
4 讨论 8
致谢 9
参考文献 9
仔猪肠道产肠毒素大肠杆菌噬菌体分离鉴定及其
裂解效力测定
引言
1 引言
断奶仔猪腹泻是如今养猪业最常见、最严重的仔猪疾病之一。有研究表明，ETEC可通过新生仔猪或断奶仔猪口腔进入肠道，在肠道内生长繁殖，产生肠毒素影响肠道功能，致畜体患病。并且ETEC可降低肠道黏膜的天然屏障防御力，肠道黏膜结构被破坏，进而影响仔猪肠道的黏膜功能[1]。造成断奶仔猪腹泻的原因主要有[23]：①断奶后母乳保护性抗体的丧失，以及断奶应激降低了仔猪自身机体免疫力，使仔猪被微生物病原所接触感染；②饲料及猪舍环境的改变，使仔猪肠道组织内的酸度及消化酶发生变化，导致采食量下降、饲料利用率降低，消化功能紊乱；③由于饲料利用率降低，大量营养物质在肠道内被病原菌利用，有利于病原菌的生长繁殖，造成菌群失调。病原菌生长繁殖产生大量的胺和毒素，刺激肠道分泌，导致腹泻。其中，产肠毒素大肠杆菌（ETEC）是引起断奶仔猪腹泻的主要病原之一，全球每年因腹泻死亡的仔猪，有50%是感染ETEC所致[4]。ETEC通过其表面特异性宿主菌毛—黏附素与宿主肠黏膜受体发生特异性的黏附作用，使ETEC定植于小肠绒毛并在肠道中大量繁殖，释放肠毒素如不耐热（LT）和耐热肠毒素（ST），使肠细胞功能紊乱，电解质和水失衡，大量流入肠腔，导致肠腔积液，超过肠道的吸收能力而出现腹泻[5]。
噬菌体是一类可以感染细菌的病毒，存在于任何有细菌的地方，影响着各种生态系统中细菌的种类和数量。人和动物的肠道病毒组测序结果表明噬菌体是肠道病毒群的主要组成[67]。噬菌体具有增殖能力强、无副作用、无残留的特性，细菌很难对其产生抗体[8]。感染细菌后的噬菌体，能在宿主菌中增殖，使细菌细胞破裂，起到杀菌作用[9]。近几年，越来越多研究者开始注意到肠道内的噬菌体和微生物区系之间的联系。噬菌体与细菌间的“捕食效应”，使肠道内噬菌体和微生物之间互相影响、相互变化，仔猪肠道的健康、生长发育与生理状态都被噬菌体的情况所直接影响[1013]。肠道环境变化严重影响肠道噬菌体和微生物菌群之间的动态关系。仔猪断奶前后肠道营养环境发生变化，那断奶仔猪肠道噬菌体如何变化？噬菌体的变化是否与仔猪腹泻有关？在幼龄阶段，肠道噬菌体对菌群的影响尤为显著。仔猪断奶后，母乳保护性抗体的丧失以及消化道功能紊乱等有利于病原菌的生长繁殖进而造成了腹泻。但若此时仔猪肠道内存在可裂解病原菌的噬菌体，是否可以减轻甚至防止腹泻的发生？
因此，本试验首次研究大肠杆菌噬菌体在仔猪肠道的分布情况，并研究肠道内天然存在的ETEC噬菌体的抑菌效力，探索肠道内的大肠杆菌噬菌体对仔猪腹泻的保护作用。
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 仪器
高压灭菌锅、电子显微镜、隔水式恒温培养箱、超净台、涡旋仪、电子天平、水浴锅、离心机、台式高速冷冻离心机、立式压力蒸汽灭锅、摇床
2.1.2 试剂
琼脂粉、氯化钠、SM保存液、氯仿、PBS缓冲液、硫酸镁、胰蛋白胨、蛋白酶K、RNaseA、酵母提取物、无水乙醇、DNaseI、BTL Buffer
2.1.3 耗材
注射器、超滤管、离心管、96孔板、1.5ml EP管、LB培养基、1.5ml EP管、0.22μm滤器（MILLEX）
2.1.4 菌株
用于分离大肠杆菌噬菌体的指示菌为实验室此前保存，其中有6株为ETEC噬菌体，6株噬菌体的毒素基因分别为101：sta；102、105、106k88：lt+stb；103：lt+sta；104：stb103
2.2 材料的制备
2.2.1 液体LB培养基的制备
在1000ml量筒中量取去离子水，大烧杯中加入5g的酵母提取物之后、再加10g的氯化钠、10g的胰蛋白胨，取量筒中去离子水倒入，将溶液充分振荡混匀后加热，使液体澄清透明，使用注射器均匀加入到试管中，用玻璃塞封住试管口并用纸固定住，静置1min，放入130℃的高压灭菌锅里进行灭菌，灭菌后待用。
2.2.2 半固体LB培养基的制备
在1000ml量筒中加入去离子水，大烧杯中分别加入5g的酵母提取物、10g的NaCl、10g的胰蛋白胨、7.5g琼脂粉，取量筒中的去离子水倒入，溶液充分混匀后加热，使用注射器均匀加入试管中，用玻璃塞封住试管口并用纸固定住，静置1min，放入130℃的高压灭菌锅里进行灭菌，灭菌后待用。

原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/562359.html