猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以呕吐和腹泻为基本特征，各日龄猪均易感，新生仔猪发病最严重。[1]该病除通过粪口传播外，本实验室的前期研究表明鼻腔也是PEDV感染致病的重要途径。因此本研究对养殖场和散养仔猪鼻腔中的PEDV进行了检测，结果显示相比于野外散养的仔猪，养殖场中仔猪鼻腔PEDV的检出率较高。进一步的研究发现，野外散养的仔猪鼻腔中枯草芽孢杆菌的种类和丰度均明显高于规模化养殖场饲养的仔猪，因此本研究尝试从野外散养仔猪鼻腔中分离、培养并鉴定枯草芽胞杆菌。通过前增菌和选择培养基培养[2，3]，我们从163份鼻腔拭子中成功分离到两株枯草芽孢杆菌，分别命名为B.S N12和B.S N15。进一步通过16s rDNA PCR、革兰氏染色、孔雀绿芽孢染色、细菌微量生化鉴定管对这两株枯草芽胞杆菌的进行了鉴定。并对这两株菌进行了36h的活菌计数，绘制了两株菌的生长曲线。最后我们对这两株枯草芽孢杆菌的粘附力、抑菌效果和抗病毒能力进行了研究。结果显示，两株枯草芽孢杆菌对Vero E6细胞均具有较好的粘附力，且对PEDV有一定的抑制能力，但抑制细菌的效果不明显。本研究结果为将来进一步研制益生菌制剂提供了理论依据。
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言5
1材料与方法5
1.1试验材料5
1.1.1试验设备5
1.1.2主要试剂5
1.1.3主要溶液5
1.2试验方法6
1.2.1样品采集6
1.2.2样品处理6
1.2.3猪鼻腔PEDV检测6
1.2.4细菌分离及鉴定6
1.2.5革兰氏染色7
1.2.6孔雀绿芽孢染色7
1.2.7生化鉴定 7
1.2.8绘制生长曲线8
1.2.9细菌粘附VERO E6细胞试验8
1.2.10抑菌试验8
1.2.11细菌抗PEDV试 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
验8
2结果与分析8
2.1猪鼻腔PEDV检测结果8
2.2细菌分离鉴定结果10
2.3革兰氏染色及孔雀绿芽孢染色结果11
2.4生化鉴定结果11
2.5生长曲线13
2.6细菌粘附VERO E6细胞试验结果14
2.7抑菌试验结果15
2.8细菌抗PEDV结果15
3讨论16
致谢16
参考文献17
猪鼻腔中枯草芽孢杆菌的分离鉴定及生物学特性研究
引言
引言
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然界且极具特点的益生菌。其细菌形态呈杆状，无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌[4]。芽孢呈椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。在培养基上，菌落边缘粗糙，呈锯齿状，不透明，颜色多为白色或微黄色，属好氧型细菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。枯草芽孢杆菌具有极强的适应能力，在高温、干燥、强酸强碱环境下仍能生存。据报道，枯草芽孢杆菌可以增强局部黏膜和全身系统免疫应答水平[5]。随着研究的不断深入，人们发现，枯草芽孢杆菌的分泌物也具有拮抗病原的作用[610]。然而，关于枯草芽孢杆菌能否粘附于局部黏膜、能否抗动物病毒方面则需要进一步研究。
猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）所引起的一种接触性肠道传染病。PED常以暴发性腹泻的形式出现。其临床表现与典型的猪传染性胃肠炎十分相似。哺乳仔猪发病症状明显，体温正常或稍偏高，表现呕吐、腹泻、脱水、运动僵硬等症状。症状的轻重与年龄大小有关，年龄越小，症状越重，l周以内的哺乳仔猪常于腹泻后2～4天内因脱水死亡，病死率约50%。[11，12]病猪和带毒猪是该病的主要传染源，研究表明病毒能随传染源的粪便排出，污染生物或非生物媒介，通过粪口途径由消化道传播[13]。最新的研究表明，PEDV也能够通过呼吸道传播，经鼻腔黏膜入侵引起肠道致病。因此阻断PEDV的呼吸道感染途径，对于有效预防PED在猪场的肆虐具有重要意义。
实验室之前已经对猪鼻腔黏膜中菌群构成进行了研究，结果显示，枯草芽孢杆菌能存在于鼻腔，并在鼻腔黏膜表面定殖。鉴于大量病原微生物可通过鼻腔进入呼吸道进而入侵机体。[1419]而有文献证实枯草芽孢杆菌具有一定抗病原微生物的作用[20]，因此本实验期望在猪鼻腔中分离出具有较好细胞粘附能力、并具有有拮抗病原微生物能力的枯草芽孢杆菌，进而为有效抑制鼻腔黏膜处PEDV的入侵提供可能。
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 试验设备
水平摇床
中国太仓实验仪器有限公司
倒置显微镜
ZEISS，德国
涡旋仪
IKA，德国
恒温培养箱
中国无锡科隆实验仪器公司
数字分析天平
Sartorius，德国
4℃高速小型离心机
Eppendorf，德国
1．1．2 主要试剂
革兰氏染色试剂盒
南京寿德公司
孔雀绿芽孢染色试剂
南京寿德公司
BCA蛋白质测定试剂盒
Thermo，美国
PAGE凝胶快速制备试剂盒（10%）
上海雅酶生物科技有限公司
ECL化学发光超敏显色试剂盒
上海翊圣生物科技有限公司
细菌微量生化鉴定管
北京陆桥技术股份有限公司
DMEM细胞培养基
HyClone，英国
1．1．3 主要溶液
（1）PBS缓冲液；LB 液体培养基；LB固体培养基。
1．2 试验方法
1．2．1 样品采集
将猪保定好之后，用灭菌的棉拭子在猪鼻腔内转动至少3圈，采集鼻腔内的分泌物。蘸取分泌物后，立即将拭子放入灭菌1.5ml离心管中，剪去露出管口的部分，盖紧离心管盖，做好标记，密封低温保存。
1．2．2 样品处理

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