传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定【字数：7372】
emical reaction test, and toxins expression were conducted against these two stains. The results showed that the strains were serotypes 2 and 5 of APP. Type 2 APP can decompose sucrose and producing gas, can decompose urea and mannitol, cant decompose aesculin, lactose, arabinose. It is sensitive to okefenokee, cefotaxime, SMZ, medium sensitive to ampicillin, streptomycin and lincomycin, and resistant to gentamicin, spectinomycin, erythromycin, penicillin. There is no hemolysis on blood AGAR plate, bacteria grow white needle on macconkey medium. APP 5 can decompose sucrose to produce gas, decompose urea and aesculin, and does not decompose lactose, mannitol or arabinose. It is sensitive to fenoxacin, SMZ, macroamycin, penicillin, lincomycin, cefotaxime, gentamicin, ampicillin, streptomycin and penicillin. Hemolysis was found on blood AGAR plates and did not grow on McConkey medium. The two strains were cultured in Columbia broth until the bacterial reaching logarithmic growth stage to identify the expression of tnxins. The supernatant was concentrated and sds-page electrophoresis was performed. No target bands were observed. The results of this study provide theory basis for the further study of APP 2 and APP 5 for development of killed vaccine, toxins gene amplification and drug application.猪传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia，PCP）是由传染性胸膜肺炎放线杆菌( Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一种发病率和死亡率均很高的猪呼吸道传染病[1]，主要以肺出血、坏死和纤维素性渗出为主要特征。APP是一种兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌[2]，属巴氏杆菌科，可形成荚膜、菌毛和鞭毛。依据其荚膜多糖及LPS的抗原性差异，将APP分为15种血清型，其中1、2、5、7、9、11血清型的毒力因子作用力最强，其他血清型毒力因子作用力较弱[3]。在致病和免疫反应中起主要作用的是APP的溶血素(Apx)，研究表明APP溶血素也是一种RTX毒素[4]。RTX毒素是一种可以使靶细胞膜变性的蛋白毒素，在一些病原性的革兰氏阴性菌中比较常见。APP共有ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ四种类型。ApxⅠ是一种具有强溶血活性和强细胞毒性的毒性蛋白，分子量大小在105～110kDa左右。ApxⅡ是一种弱溶血活性和弱细胞毒性的毒性蛋白，分子量大小在103～105 kDa左右。ApxⅢ没有溶血活性，但却有很强的细胞毒性，其分子量大小在120kDa左右[5]。ApxⅣ是近年来新发现的一种毒性蛋白，且只有在动物体内感染时才能表达，在培养基中不能培养出该蛋白，分子量大小为202kDa。不同血清型APP表达的毒素不同，但是没有一种血清型APP可以同时产生所有的Apx毒素，多数只能产生2种，如血清型1、5、9、10、11产生的是ApxⅠ和ApxⅡ，血清型2、3、4、6、8 产生的是ApxⅡ和Apx Ⅲ，少数血清型只能产生一种Apx毒素，如血清型10只产生ApxⅠ这一种溶血素，血清型 7、12 只产生ApxⅡ这一种溶血素[6]。近年来随着养猪业的发展，PCP的爆发率和致死率越来越高，全世界养猪业都承受着不同程度的影响，Apx毒素的研究成了预防PCP的重要途径。因为不同血清型之间的抗原性差异，不同血清型之间的交叉保护力低，导致灭活疫苗不能对所有的APP感染进行防控，甚至同型之间也不能提供全部的保护，对该病的预防起到极大的阻碍作用。所以对各种血清型APP的特性研究也成了当下防控PCP的主要途径，通过对各型APP的了解，在疾病爆发时，可采取及时有效的措施，抑制病情的发展，最大程度上减少经济的损失。本实验研究主要是通过革兰氏染色镜检、PCR法对两种菌株进行血清型鉴定，在此基础上对2型APP和5型APP进行生化反应试验和药敏试验，并对其在上清液里的毒素表达进行实验研究。材料与方法1.1 主要试剂胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA）和胰蛋白胨大豆酵母肉汤培养基（TSB）均来自OXOID公司，哥伦比亚肉汤购自上海瑞楚生物科技有限公司，异维他林（BBL）购自美国BD公司，抗生素药敏试验纸片和细菌微量生化反应管均从杭州滨和微生物试剂有限公司购买，血琼脂平板和麦康凯培养基购自无锡市赛微生物技术有限公司，NAD购自BioSharp公司，新生牛血清购自Life公司，引物和探针由Thermo Fisher公司合成，快速银染试剂盒是从碧云天生物科技有限公司购买。1.2 方法1.2.1细菌的分离培养在超净台中，挑取部分菌粉，用无菌玻璃棒按z字形将菌划线于TSA固体培养基上，置37℃温箱培养24小时。长出菌落后，TSB液体培养基按照3mL加入100µL NAD和200µL血清，按每管600µL加入到EP管中，挑取单菌落吹打到EP管内，在37℃，200rpm的摇床上培养12小时。取30µL新鲜摇好的菌液加到3mL TSB的无菌试管里，在37℃，200rpm条件下的摇床里培养12小时用于实验。1.2.2 细菌的染色 对涂板后的平板菌培养，再在液体培养基中培养起来，后进行革兰氏染色，油镜（×100）观察菌体形态特征。革兰氏染色过程涂片取10µL菌液滴在载玻片上，在超净台里，用无菌接种环将菌液均匀地涂开，风干后形成薄膜。固定将载玻片在酒精灯上方快速来回移动，以温度不超过60℃为宜，等水分蒸发后，放置冷却；初染在涂片薄膜上滴3滴结晶紫染液，染色40s，用水冲洗；媒染滴加2滴革兰氏碘液覆盖涂片，染色1min，水洗备用；脱色加入95%乙醇脱色液脱色，脱色约30s，直至流出液体无紫色为止；复染滴加沙黄水液2-3滴复染1 min，水洗至无色，放置干燥；镜检观察。1.2.3菌株鉴定及其血清型鉴定引物序列设计 参照GenBank中注册的传染性胸膜肺炎放线杆菌APP Ⅳ基因序列设计一段通用引物。通用引物序列和分型引物序列如表1。以不加菌液加入ddH2O为扩增序列作为阴性对照[7]。通用引物预期的扩增条带的大小为442bp。表1 通用引物与分型引物序列引物 序列通用引物 F -TGGCACTGACGGTGATGA-R -GGCCATCGACTCAACCAT-分型引物 IA F -ATCGAAGTACATCGCTCGGA- R -CGCTAATGCTACGACCGAAC- IB F -TTATCGCACTACCGGCACTT- R -TGCAGTCACCGATTCCACTA- II F -GAAGTATGGCGAGAAGAACG- R -CGTAACACCAGCAACGATTA- Ⅲ F -GCAATCAGTCCATTGGCGTT- R -GACGAGCATCATAGCCATTC-Ⅳ F -GCGAAACAATTCGAAGGGC- R -GGGCCATCGACTCAACCAT-以新鲜的菌液为模板，用上述引物扩增，反应体系如下表表2 反应体系加入物 规格2 ×Phanta Mix 12.5µL上游引物 1.0µL下游引物 1.0µLDNA模板 1.0µL ddH2O 9.5µL 总计 25µL通用引物PCR扩增条件 表3 通用引物扩增条件程序 时间94℃预变性 5min94℃变性 30s52℃退火 30s72℃延伸 1-3min 上述反应进行35个循环72℃延伸 7min分型引物PCR扩增条件为表4 分型引物扩增条件程序 时间94℃预变性 5min94℃变性 30s60℃退火 30s72℃延伸 1-3min 上述反应进行35个循环72℃延伸 7min注IA、IB、Ⅱ、Ⅲ在72℃延伸1min，Ⅳ在72℃延伸3min。取10µL PCR产物进行核酸凝胶电泳分析，对结果进行比对分析。表5 1-10型菌株PCR结果对照表血清型 片段大小/bp Fragment sizeSerotype ApxIA ApxIB ApxII Apx Ⅲ ApxⅣ ApxⅣ ApxⅣ ApxⅣ723 811 965 396 1600 2000 2400 2800 1 + + + + 2 + + + + 3 + + + 4 + + + + 5a + + + + 5b + + + +6 + + + + + +7 + + + 8 + + + + 9 + + + +10 + + +注＋表示有条带1.2.4细菌生长曲线的测定将TSB液体培养基取3mL分装在无菌试管中，加入100µL NAD和200µL新生牛血清，在超净台里用无菌接种环选单菌落，吹打入液体培养基中，在37℃，200 rpm条件下振摇，振摇1.5h后测其OD600mm值，后每半个小时测一次，根据数值绘制细菌生长曲线。1.2.5细菌生化试验 无菌接种环沾取新鲜菌液，竖直不贴壁将菌接种在细菌微量生化反应管中，开口向下，放置在37℃灭菌培养皿中培养18-24h，观察并记录结果。1.2.6细菌药物敏感试验 最常用圆纸片扩散发用于药敏试验。将新鲜菌液取100mL，均匀四角滴于TSA平板上，用灭菌玻璃棒致密划线涂匀平板。将镊子用酒精灯消毒后，取各种抗菌药物的纸片，贴在涂了菌的培养基的表面，每一片间的距离要相等均匀，在37℃无菌温箱里培养18-24h，用尺子测量抑菌圈的直径[8]，鉴定待检菌株对各种药物的耐药情况，记录结果并分析。1.2.7细菌溶血试验用新鲜的菌液，在超净台里，用无菌玻璃棒触取新鲜的菌液，在血琼脂平板式按z字型划线，标记，在37℃的无菌温箱里培养18-24h，观察其溶血现象，记录结果。1.2.8麦康凯培养基取新鲜的菌液，在超净台里，用无菌玻璃棒触取新鲜的菌液，在麦康凯平板上按z字型划线，标记，在37℃的无菌温箱里培养18-24h，观察其长菌情况，记录结果。1.2.9毒素表达的鉴定 将菌株于培养基中摇至细菌指数增长阶段（OD600值至0.8左右）[9]，取上清液浓缩5-10倍，将浓缩液跑SDS-PAGE电泳，看是否有目标条带，鉴定是否有溶血素表达。SDS-PAGE蛋白电泳灵敏度可达ug，而银染灵敏度可达ng。具体操作步骤如下在3mL哥伦比亚肉汤的无菌试管中加入1%的BBL和10ug/mL的NAD和10mM CaCl2，在37℃，130rpm振摇12个小时。在装有40mL哥伦比亚肉汤液体培养基的锥形瓶中按比例加入BBL、NAD和CaCl2，加入过夜摇好的试管中的菌液400µL，在37℃，130rpm的摇床里培养OD600值至0.8左右。将锥形瓶中的菌液离心（6000rpm），将离心后的上清液在过滤管中离心浓缩。吸取80ul浓缩液，加入20µL 5×Loading Buffer吹打均匀重悬。将沉淀用1×PBS清洗两次，离心（13000rpm）倒掉上清液，沉淀加入80µ1× PBS重悬，加入20µL 5×Loading Buffer吹打均匀后重悬。将样品于水浴锅里煮10分钟。测蛋白浓度试剂A液200µL；B液4µL；混合均匀。吸浓缩液样品25µL，将样品与测蛋白浓度试剂相混合，吹打均匀后放入烘箱，30min。取出测其蛋白浓度。取30µL浓缩液样品与沉淀样品SDS-PAGE电泳，记录结果并分析。快速银染步骤如下固定在SDS-PAGE电泳完成后，往凝胶中倒入20mL固定液，常温条件下，在60-70rpm的摇床上摇20min。固定液的配制将10mL乙醇、2mL乙酸和8mL 高压过的ddH2O混匀成20mL固定液。30%乙醇洗涤倒掉固定液，倒入20mL 30%乙醇，同（a）条件摇10min。30%乙醇的配制在14mL高压过的ddH2O加入6mL乙醇，混匀。水洗涤弃掉乙醇洗涤液，加入20mL高压过的ddH2O，同（a）条件摇10min。增敏弃水洗涤液，加入20mL银染增敏液(1X)，同（a）条件摇2min。银染增敏液(1X)的配制19.8mL高压过的ddH2O中加入0.2mL银染增敏液(100X)，混匀在20mL银染增敏液(1X)。水洗涤(共2次)弃掉增敏液，加入20mL高压过的ddH2O，同（a）条件摇1min，再重复洗一次。银染弃水，加入20mL银溶液(1X)，同（a）条件摇10min。银溶液(1X)的配制19.8mL高压过的ddH2O中加入0.2mL银溶液(100X)，混匀后即为银溶液(1X)。水洗涤弃原有溶液，加入20mL高压过的ddH2O，同（a）条件摇1-1.5min。显色弃水，加入20mL银染显色液，室温条件下，在摇床上摇动3-10min，直到出现理想的蛋白条带。银染显色液的配制16mL高压过的ddH2O中加入4mL银染基本显色液(5X)，再加入0.01mL银染显色加速液(2000X)，混匀。 终止倒掉银染显色液，加入20mL银染终止液(1X)，在同（a）条件摇10min，可能会有CO2气体产生。银染终止液(1X)的配制19mL高压过的ddH2O中加入1mL银染终止液(20X),混匀后就是银染终止液(1X)。水洗涤弃银染终止液，加入20mL高压过的ddH2O，在同（a）条件摇2-5min。保存保存在高压过的ddH2O中。实验结果革兰氏染色镜检结果革兰氏染色结果显示两种菌均为小的球状杆菌或中等大小的杆状菌，呈线状或多形性，两极着色明显，可鉴定该菌为革兰氏阴性菌（如图1）。图1 革兰氏染色镜检2.2 菌株鉴定结果对疑似APP的两株菌株进行通用型引物PCR扩增后经电泳，在凝胶成像仪中可见扩增产物在442bp处有明显的扩增目标条带(图2)，与阴性对照的结果，根据引物序列条带大小比对，与预期的结果相符合。证实该菌为传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）。MDL-5000 Maker；1~4阴性对照；5~6检测样品图2 通用型引物扩增结果2.3血清型鉴定结果PCR分型引物扩增结果显示如图3A，引物ApxIA无条带，引物ApxIB片段大小约为811bp，ApxII片段大小约为965bp，ApxⅢ片段大小约为396bp，ApxⅣ片段大小约为2800bp，对照表5，可判定该APP的血清型为2型。如图3B，ApxIA片段大小约为723bp，ApxIB片段大小约为811bp，ApxII片段大小约为965bp，ApxⅢ无条带，ApxⅣ片段大小约为2800bp，对照表5，可判定该APP血清型为5型。 MDL5000Maker；1IA阴性对照；2IA检测样品；3IB阴性对照；4IB检测样品；5II阴性对照；6II检测样品；7Ⅲ阴性对照；8Ⅲ检测样品；9Ⅳ阴性对照；10Ⅳ检测样品；11IA阴性对照；12IA检测样品；13IB阴性对照；14IB检测样品；15II阴性对照；16II检测样品；17Ⅲ阴性对照；18Ⅲ检测样品；19Ⅳ阴性对照；20Ⅳ检测样品图3 分型引物扩增结果2.4 细菌生长曲线根据测量APP 2型和5型在摇床中培养不同时间的OD600nm值，分析后绘制APP 2型和5型的生长曲线图。根据细菌生长曲线图显示（图4），2型和5型APP在2.5h后均进入对数生长期。2型在5.5h后趋于稳定，OD600值在2.7左右。5型在3.5h后趋于稳定，OD600值在2左右。图4 APP 2型和5型的生长曲线图2.5细菌生化试验生化试验结果如表所示2型APP能利用蔗糖并产气，可分解尿素和甘露醇，不利用七叶苷、乳糖、阿拉伯糖。5型APP可利用蔗糖并产气、可分解尿素和七叶苷，不利用乳糖、甘露醇、阿拉伯糖。表6 生化鉴定结果生理生化试验血清型2型血清型5型蔗糖尿素七叶苷 乳糖甘露醇阿拉伯糖＋ 产气＋－ －＋－+ 产气＋＋－－－注: + 显示阳性，－显示阴性。2.6 细菌药物敏感试验结果对两种菌株进行了常用抗生素的敏感性试验，以便于指导临床用药，结果见表。根据提供的标准进行鉴定，2型APP对弗诺沙星、头孢噻肟、复方新诺明、氨苄西林、链霉素敏感，对林可霉素中介，对庆大霉素、大观霉素、红霉素、青霉素具有耐药性。5型APP对弗诺沙星、 复方新诺明、大观霉素、青霉素、敏感，对林可霉素中介，对头孢噻肟、庆大霉素、氨苄西林、链霉素、青霉素具有耐药性，详见表7。 表7 2型和5型血清型抑菌圈直径 mm药物 抑菌圈直径判定标准 R I S 2型 抑菌圈直径（mm） 耐药性5型 抑菌圈直径（mm） 耐药性弗诺沙星 ≤15 16-18 ≥19头孢噻肟 ≤14 15-22 ≥22林可霉素 ≤14 15-20 ≥22复方新诺明 ≤12 13-16 ≥17庆大霉素 ≤12 13-14 ≥15氨苄西林 ≤13 14-16 ≥17链霉素 ≤11 12-14 ≥15大观霉素 ≤19 - ≥20红霉素 ≤13 14-22 ≥23青霉素 ≤10 11-19 ≥2023 S23 S20 I22 S0 R23 S15 S19 R9 R10 R20 S10 R20 I19 S0 R0 R0 R20 S27 S0 R注:S表高度示敏感；I表示中度敏感；R表示耐药，不同药物判定的标准不同。2.7 细菌溶血试验细菌的溶血试验结果如图5所示，2型APP在绵羊血平板可见透明或半透明的灰白色菌落，未见明显的溶血现象（如图5A）。5型APP在绵羊血平板中产生透明灰白色的较大的、粗糙的、黏液样菌落，菌落周围形成一圈宽大透明、界限明显的溶血环，鉴定为β-溶血（如图5B）。图5 2型(5A)和5型（5B）在血琼脂平板生长情况2.8 麦康凯培养基生长情况 两种细菌在麦康凯培养基上的长菌情况如下图所示，2型APP在麦康凯培养基上长出白色、针尖状的白色菌体（图6A），5型APP在麦康凯培养基上没有反应，不长菌（6B）。图6 2型（6A）和5型（6B）在麦康凯培养基上的生长情况2.9 毒素的表达 细菌在培养后的OD600值与蛋白浓度值如（表8）。SDS-PAGE蛋白条带、银染凝胶条带结果如图（7）蛋白胶未见有目标条带，银染胶上未见有目标条带。重复多次实验均得到相类似的结果。表8 细菌OD600值与蛋白浓度的测定 血清型 OD600值 蛋白浓度值（mg/mL）2型 0.804 2.5665型 0.867 2.648图7 SDS-PAGE蛋白凝胶（7A）和银染凝胶(7B)分析与讨论 通过对两种血清型APP的形态学的观察和生物学特性的分析，证实了两种菌虽然为同一种菌，但由于血清型的差异，两者在形态结构和生物学特性上均有很大的差异。猪传染性胸膜肺炎是我国猪群中一种常见的发病率和死亡率都很高的危害养猪业的细菌性呼吸道传染病，因为APP的血清型众多且不同血清型缺乏交叉保护力和生物学特性存在差异，故对其各种血清型的特性研究成了当前研究的热点。形态学和PCR方法可快速对其进行鉴定，药敏试验可在疾病爆发时，为及时准确地选用药物，有效抑制病情的发展，减少猪群的发病率和死亡率具有重要的参考价值。对各种血清型的毒力因子的产生情况及其机制进行探讨可以深入了解APP的致病机制。从而为对疫苗的研究，预防疾病提供重要的理论依据。养猪场在疾病爆发时，可通过其生物学特性，同时结合药敏试验，合理使用抗生素和疫苗。2型APP主要分泌ApxⅡ、ApxⅢ，5型分泌ApxⅠ、ApxⅡ。ApxⅠ具有强溶血活性，ApxⅡ具有弱溶血活性，ApxⅢ无溶血活性。虽然胸膜肺炎菌株在绵羊血琼脂上有溶血作用，但血清型2不能分泌出可检测到的热不稳定溶血素，而血清型5可以，故血清型5菌落周围的β-溶血圈会明显大于其他血清型菌落周围的β-溶血圈[10]。麦康凯培养基主要用于抑制革兰氏阳性菌的生长，但也抑制少数的革兰氏阴性菌。APP在麦康凯培养基上不生长，但实验表明2型APP在麦康凯培养基上可长菌，对其在麦康凯培养基生长现象需要进一步研究。通过对其耐药性的测定，发现2型APP对弗诺沙星、头孢噻肟、复方新诺明、氨苄西林、链霉素敏感，而5型APP则对弗诺沙星、复方新诺明、大观霉素、红霉素敏感，临床上应用可根据其血清型选择正确有效的治疗药物，以便及时有效地控制病情的发展。胸膜肺炎杆菌菌株在某些培养基中可产生少量溶血素或不产生溶血素，菌株的溶血素在不同培养基中的稳定性也可能不同。APP除了内毒素外，还可产生热稳定细胞毒素、热稳定溶血素、热不稳定细胞毒素和热不稳定溶血素。5型可产生细胞毒素和溶血素，2型只释放溶血素，两者均热不稳定，细胞毒素在100℃下加热1 h后完全失活，溶血素在60℃下加热1 h后失活，且2型与5型溶血素的活性需要RNA。细菌上清液在浓缩后，蛋白浓度很高，在SDS-PAGE蛋白胶和银染中未见有目标毒素条带。分析可能有以下几种原因（1）细菌未释放出溶血素在上清液中，但上清液中有大量分子量较小的蛋白，故测得其蛋白浓度较高，却不见条带。（2）2型和5型释放的溶血素对超滤浓缩管有很强的吸附作用，故在蛋白胶中未出现条带，因此，需要探讨其它形式的蛋白浓缩。（3）细菌在培养过程中释放出了溶血素，但因其生物活性过低，在培养过程中降解，故无条带。致谢 感谢导师的谆谆教诲、感谢实验室师兄师姐们的帮忙，我在本次毕业设计中受益匪浅。参考文献俞正玉, 周俊明, 倪艳秀, et al. 规模化猪场胸膜肺炎放线杆菌血清5型的分离与鉴定[J]. 畜牧与兽医, 2015, 47(7):91-93.猪场胸膜肺炎放线杆菌分离鉴定、血清型鉴定及药敏试验[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2017(22):116-119+305.郭志英, 李郁, 吴浩阳, et al. 猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及其生物学特性的研究[J]. 中国兽医科学, 2016(9):1102-1109.石琴, 贺英, 赵萍, et al.猪胸膜肺炎放线杆菌溶血外毒素研究进展.动物医学进展, 2006, 27(z1):16-18. 宣春玲, 王贵平, 李春玲, et al. 胸膜肺炎放线杆菌溶血外毒素研究进展[J]. 动物医学进展, 2009, 30(6).马艳芳, 张鑫, 张瑞平, et al. 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血素的研究进展[J]. 福建农业学报, 2008, 23(1):111-115.李海利, 朗利敏, 徐引弟, et al. 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型PCR程序优化及分子鉴定[J]. 现代畜牧兽医, 2015(1):33-39.郭志英, 李郁, 吴浩阳, et al. 猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及其生物学特性的研究[J]. 中国兽医科学, 2016(9):1102-1109.Frey J , Nicolet J . 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目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1主要试剂2
1.2方法2
1.2.1细菌的分离培养2
1.2.2细菌的染色2
1.2.3菌株鉴定及血清型鉴定3
1.2.4细菌生长曲线的测定 4
1.2.5细菌生化试验 4
1.2.6细菌药物敏感试验 4
1.2.7细菌溶血试验 4
1.2.8麦康凯培养基 4
1.2.9毒素表达的鉴定5
2实验结果5
2.1革兰氏染色镜检结果5
2.2菌株鉴定结果6
2.3血清型鉴定结果6
2.4细菌生长曲线 7
2.5细菌生化试验 7
2.6细菌药物敏感试验结果 7
2.7细菌溶血试验结果 8
2.8麦康凯培养基生长情况 8
2.9毒素的表达9
3分析与讨论9
致谢10
参考文献10
传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定
动物药学学生 罗巧丽
引言
原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/dwyx/562173.html
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