：S-层蛋白（S-layer protein）是乳酸杆菌表面的一层蛋白分子，近年来发现该蛋白对肠道病原菌具有拮抗作用。通过细胞凋亡引起宿主细胞感染是猪流行性腹泻病毒（PEDV）重要作用机制之一。本文旨在探讨乳酸杆菌S-层蛋白拮抗PEDV感染对细胞凋亡的影响。首先提取乳酸杆菌的S-层蛋白，通过排斥试验和竞争试验研究S-层蛋白对PEDV感染非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）的拮抗作用；然后检测S-层蛋白拮抗PEDV对Vero细胞凋亡的影响。结果显示：排斥试验中S-层蛋白显著拮抗PEDV感染，S-层蛋白作用后PEDV病毒滴度从106.52±0.04TCID50/ml下降为105.13±0.07TCID50/ml，差异极显著（P＜0.01）；而竞争试验中S-层蛋白对PEDV的感染不存在拮抗作用。DAPI和Annexin V-PI染色分别发现，S-层蛋白可显著拮抗PEDV感染引起的Vero细胞凋亡。结果表明，乳酸杆菌S-层蛋白可能通过拮抗PEDV感染Vero细胞凋亡的影响发挥拮抗作用，该结果可为揭示乳酸杆菌S-层蛋白拮抗PEDV感染作用机制奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1. 1试验材料 2
1. 1. 1菌株、细胞和病毒 2
1.1.2试验试剂2
1.1.3主要溶液配制2
1.1.4主要设备2
1.2 试验方法和观测指标3
1.2.1 细胞培养3
1.2.2 细菌培养3
1.2.3 S层蛋白提取3
1.2.4乳酸杆菌S层蛋白对PEDV的拮抗试验3
1.2.5 S层蛋白拮抗PEDV感染的浓度依赖性试验3
1.2.6 间接免疫荧光法检测S层蛋白拮抗PEDV感染3
1.2.7 DAPI染色法观察层蛋白对细胞凋亡的影响4
1.2.8 AnnexinⅤPI法检测S层蛋白拮抗PEDV诱导细胞凋亡的影响4
2 结果与分析4
2.1 提取的乳酸杆菌S层蛋白浓度4
2.2 S层蛋白拮抗PEDV感染的浓
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度依赖性实验4
2.3 DAPI染色法检测S层蛋白对细胞凋亡的影响5
2.4间接免疫荧光检测S层蛋白拮抗PEDV感染5
2.5 Annexin VPI检测S层蛋白拮抗PEDV感染对细胞凋亡的影响6
3 讨论7
致谢8
参考文献8
乳酸杆菌s层蛋白拮抗PEDV感染对细胞凋亡的影响
引言
引言：细胞凋亡是一种不引起机体炎症反应的细胞自主的程序性死亡的过程。乳酸杆菌S层蛋白主要是通过粘附宿主细胞，从而作用于宿主细胞来拮抗细胞凋亡。有报道称，乳酸杆菌S层蛋白是通过抑制Caspase的活性来显著拮抗细胞凋亡的[1]。虽然有许多研究都集中在S层蛋白，但其生物学功能仍知之甚少。
PEDV，即猪流行性腹泻病毒，是猪流行性腹泻病的病原，为冠状病毒科冠状病毒属的成员[2]。感染上PEDV的病猪会出现明显的水样病变，有时可能伴有呕吐。感染猪只在腹泻初期或在腹泻出现以前可出现急性死亡，特别是应激性高的猪死亡率更高[3]。有研究表明，PEDV的木瓜样蛋白酶（PLP）是病毒感染细胞的关键元素，而其在细胞凋亡中也同样关键。在宿主的相互作用中，PEDV通过PLP激活Caspase3诱导细胞凋亡完成自身复制与表达[4]。PEDV感染细胞也能够拮抗细胞存活信号通路，引起细胞凋亡，,其中凋亡调节因子Bcl2、caspase3和caspase8在细胞凋亡发生过程中起关键作用[5，910]。如果对PEDV入胞过程进行研究，就可以切断此过程，起到对PEDV感染的治疗作用。
由于在活体状态下，动物体内复杂的环境使PEDV与宿主的作用难以明显的表达出来，因此，本次试验使用了Vero细胞作为体外细胞模型。Vero细胞（即非洲绿猴肾细胞）是在细胞培养中常用的一个细胞系，PEDV可在其上生长，使其发生病变。
本试验旨在探讨乳酸杆菌S层蛋白拮抗PEDV感染对细胞凋亡的影响。本试验选择PEDV弱毒株作为研究对象。首先提取乳酸杆菌的S层蛋白，然后应用Vero细胞，深入研究了乳酸杆菌S层蛋白拮抗PEDV感染对细胞凋亡的影响，为今后的乳酸杆菌S层蛋白的临床应用打下坚实的理论基础。
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 菌株、细胞和病毒
乳酸杆菌ATCC4356(Lactobacillus ATCC 4356)购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
Vero细胞系（African green monkey kidney cell）购自ATCC（American Type Culture Collection，USA）；
PEDV病毒NJ株由国家生物制品工程技术研究中心自行分离。
1．1．2 试验试剂
表1 主要试剂及制造厂家
试剂
厂商
DMEM培养基
美国Invitrogen公司
胰蛋白酶
美国Invitrogen公司
PBS
试验室提供
胎牛血清
杭州四季青生物工程材料有限公司
盐酸胍
翼飞雪生物科技公司
蛋白Marker
南京生兴生物技术公司
丙烯酰胺
翼飞雪生物科技公司
SDS
翼飞雪生物科技公司
BCA法蛋白定量试剂盒
碧云天生物技术研究所
DAPI
碧云天生物技术研究所
酶标二抗
博士德生物
AnnexinⅤFITC细胞凋亡检测试剂盒
碧云天生物技术研究所
其他试剂均为国产分析纯。
1. 1. 3 主要溶液配制
MRS培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，牛肉膏10 g，葡萄糖5 g，乙酸钠5 g，柠檬酸二铵2 g，吐温80 1 mL，K2HPO4 2 g，MgSO47H2O 0.2g，MnSO4H2O 0.05 g，水1000 mL，115℃，1×105 Pa灭菌20 min，冷却到室温后保存至4℃冰箱。
TBST：先配PH8.0的1mol/LTrisHCl，121.1gTris置于1L烧杯中，加入约800mL去离子水，加约42mL浓HCl，定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。然后取20mLTrisHCl，加入8.8gNaCl，加800mL水后加0.5mLTween20，定容至1L，保存至4℃冰箱。
PBST：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO412H2O3.58g，KH2PO40.27g，溶于800mL去离子水，调节溶液的PH值至7.4，加入0.5mLTween20，最后定容至1L即可，121℃，15min灭菌，保存于室温或4℃冰箱中。

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