为了得到高活性的联产乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的枯草芽孢杆菌冻干菌粉，对影响重组枯草芽孢杆菌的发酵培养基和冻干保护剂成分进行优化，建立制备活性冻干菌粉的最佳工艺。首先对发酵培养基种类，碳源，氮源，抗生素(卡那霉素)浓度进行优化，结果表明葡萄糖含量为3.50 g/L，蛋白胨含量为1.00 g/L，酵母膏含量为2.00 g/L，抗生素含量为50 μg/mL时，酶活有较大提高，测得乙醇脱氢酶酶活为139.80 U/mL，比优化前提高了3倍，乙醛脱氢酶为3.64 U/mL，比优化前高了14倍。然后采用 Plackett-Burman 设计法，对影响乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶活的冻干保护剂的6 个成分进行筛选，结果表明具有显著影响的因子是抗坏血酸、菊糖和蔗糖。使用Box-Behnken原理设计进行响应面试验，对显著影响因子的最佳水平和交互作用进行研究，确定出最佳冻干保护剂配方抗坏血酸3.50 g/L，菊糖7.00 g/L，蔗糖6.39 g/L，优化后乙醇脱氢酶酶活存活率为40.71%，较优化前提高不大，乙醛脱氢酶酶活存活率为87.61% ，较优化前提高了2 倍。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言...3
1 材料与方法4
1.1材料 ...4
1.2 主要实验设备........5
1.3 实验方法..............5
1.3.1培养基优化.......5
1.3.2冻干保护剂的优化....6
2 结果与分析7
2.1培养基优化实验结果.............7
2.1.1不同培养基对ADH和ALDH酶活的影响......7
2.1.2葡萄糖浓度对ADH和ALDH酶活的影响..7
2.1.3蛋白胨浓度对ADH和ALDH酶活的影响...................8
2.1.4酵母膏浓度对ADH和ALDH酶活的影响...................8
2.1.5抗生素浓度对ADH和ALDH酶活的影响...................9
2.1.6验证实 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
验.........................................................9
2.2冻干保护剂优化实验结果...9
2.2.1 PlacketBurman试验对主要因素的筛选9
2.2.2响应曲面试验结果及分析.................10
3 讨论 12
致谢 12
参考文献13
联产乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性枯草芽孢杆菌冻干粉的制备工艺优化
引言
condition optimization
枯草芽孢杆菌作为一种革兰氏阳性细菌，由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础及生产技术[1]，是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主，成为原核表达系统中的一种重要的模式菌株。
乙醇脱氢酶（ADH）是含有金属锌的二聚体酶，其活性位点可催化各类醇醛反应，但要求NAD（H）充当辅酶[2]。乙醇脱氢酶在生物医疗、酶工程和污水处理等领域应用广泛，是催化醇类和醛酮物质反应的关键酶[35]，例如氧化短链醇、芳香醇等[6]，还可在柔和的反应条件下，将含有多个小基团的大体积酮或酮酯选择性氧化还原成相应的单一手性醇类[78]。就国内ADH的应用研究现状来看，ADH可快速准确地监测出乙醇的含量及浓度，可用于人的各项检测例如检查是否酒驾，同时对后续解酒药的研发也有启迪作用[9]；ADH还可以降解乙醇废水废渣，在一定程度上起到保护生态环境的作用，目前已经初步应用在污水处理工厂中[10]，同时ADH也可被作为新的实验材料,用于开展各种新领域的研究[11]。乙醛脱氢酶(ALDH)广泛存在于真核生物和原核生物中,在辅酶I存在的条件下,它催化包括乙醇在内的某些一级或二级醇、醛和酮的脱氢反应[12]。ALDH 在解酒过程中重在加速乙醛的分解,使之产生乙酸,进一步分解为CO2和H2O，可缓解由乙醛引起的急性酒精中毒症状[13]；ALDH 2还是体内重要的氧化应激分子，ALDH 2野生型能够减少体内的氧化应激，减缓动脉粥样硬化进展[14]，增加斑块的稳定性,减少心肌梗死；ALDH 1还可作为乳腺癌预后判断的指标，可用于鉴别乳腺癌组织中的“类干细胞”群落[15]。
实验室前期构建了一株联产乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的重组枯草芽孢杆菌，为了提高产品稳定性和安全性，可以运用真空冷冻干燥（简称“冻干”）技术将含水物质预先冻结成固态，然后在真空状态下使其中的水从固态升华成气态，以除去水分而保存物质[16]。冻干过程不可避免地对乳酸菌造成一定的生理损伤，包括冻干过程的机械损伤、溶质损伤、细胞膜损伤、蛋白质变性失活以及细胞代谢调节作用损伤等[17]，从而降低细胞存活率，影响其发酵性能。为了减少冷冻干燥导致的损伤，提高细胞抵御冷冻的能力，人们往往通过添加保护剂的方式保持细胞的高活力[18]，优化冻干保护剂的配方可以大大降低冻干损伤。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株
枯草芽孢杆菌 BS001/ pBE scADHistALDH由大学食品科技学院酶工程实验室保藏。
1．1．2 培养基与溶液
LB培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，加水定容至1000 mL。配制固体培养基时，每1000 mL加入20 g 琼脂。
液体种子培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，葡萄糖1g ，kana的终浓度为25μg/mL。
发酵培养基：
培养基一：玉米粉12.98 g，葡萄糖5 g，豆饼粉20.11 g，鱼粉5.00 g， CaCO3 6.90 g，(NH4)2SO4 1.00 g，K2HPO4 0.30 g，MgSO47H2O 0.20g，MnSO4H2O 0.20 g，加水定容至1000ml。
培养基二：麦芽浸粉 1.00 g，黄豆粉 15.00 g，CaCO3 6.68 g，MnSO4 0.40 g，MgCl2 2.00 g，加水定容至1000ml。
培养基三：葡萄糖25.00 g，豆饼粉60.00 g，玉米浆8.00 g，加水定容至1000ml。
培养基四：葡萄糖12.11 g，牛肉膏23.31 g，KH2PO42.33 g，加水定容至1000ml。
培养基五：葡萄糖3.50 g， 蛋白胨0.83 g， 酵母膏0.50 g，KH2PO4 0.35 g，CaCO3 0.25 g，加水定容至1000ml。

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