肠出血型大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC）O157:H7是一种能够引起人类肠道疾病的大肠杆菌，该肠道微生物因为能够产生志贺毒素（Shiga Toxin，Stx）从而导致宿主出血性腹泻，甚至引起肾功能衰竭。为探究肠致病性型大肠杆菌与肠炎发生的关系，本文首先进行预实验，选择合适的小鼠品系建立肠炎模型；根据前期试验结果发现致病性大肠杆菌能引起宿主更强的免疫反应，因此推测与毒力蛋白相关；采用同源双交换敲除基因的技术对大肠杆菌O157:H7 EDL933中的stx基因进行敲除，构建EDL933志贺毒素基因缺失株；再将EDL933志贺毒素基因缺失株对小鼠进行灌胃处理，观察小鼠体重变化、粪便状况、活动情况等。实验预计结果EDL933志贺毒素基因缺失株在小鼠肠道中的致病能力降低，由此进一步研究EDL933志贺毒素与肠炎发生的关系，并进一步研究大肠杆菌与肠炎发生间存在的微生物与宿主相互作用的机理。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法5
1.1实验材料 5
1.2常用溶液与培养基及培养条件 5
1.3实验用酶及试剂5
1.4抗生素与浓度5
1.5实验主要仪器设备5
1.6引物合成5
1.7试验方法6
1.7.1建立小鼠肠炎模型 6
1.7.2 HE染色 6
1.7.3细菌基因组DNA的提取 6
1.7.4扩增stx1基因的上下游片段 7
1.7.5扩增出片段14 7
1.7.6提取质粒pEX18Gm 8
1.7.7大肠杆菌感受态细胞的制备 8
1.7.8构建重组质粒 8
1.7.9二亲接合 9
2结果与分析 9
2.1小鼠肠炎模型的建立 9
2.1.1 C57品系的小鼠肠炎模型的建立 9
2.1.2 BALB/C品系的小鼠肠炎模型的建立 11
2.2构建志贺毒素缺失株 12
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2.2.1扩增stx1基因的上下游片段 12
2.2.2扩增出片段14 13
2.2.3 构建重组质粒 13
2.2.4二亲接合14
3讨论 14
致谢15
参考文献15
肠致病性大肠杆菌志贺毒素与肠炎发生关系的研究
引言
引言
肠道内存在许多已经进化并已适应在其内生长的细菌，我们称这样的微生物为肠道微生物[1]。人类肠道微生物包含了超过400种细菌[2]，数量是人体真核细胞数量的10倍左右[3]。在健康人体的胃肠道细菌中，拟杆菌门和厚壁菌门多于90%，包括拟杆菌属、卟啉单胞菌属、普氏菌属、梭状芽孢杆菌、真杆菌属、柔嫩梭菌属、乳杆菌属和瘤胃球菌属等。其他丰度较少的门类有变形菌门、放线菌门、产甲烷古菌和疣微菌门等[4]。在之前的研究中，证明了肠道微生物对宿主有生理和病理上的影响，主要功能包括促进生物体的代谢作用，回收可吸收的营养物质和能量，具有对肠上皮细胞和免疫结构的营养作用，以及保护宿主免受外来微生物的入侵[5]。肠道微生物在人体内发挥着重要的作用，此外肠道菌群失调也会导致人体炎症性肠炎、胃肠功能紊乱、自身免疫性疾病甚至胃肠道癌症。因此人们也慢慢认识到维持肠道微生物平衡的重要性，但是除了人体已经存在的肠道菌群，外来的有害寄生菌群也引起大家的注意力。
肠出血型大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC）是一种产生志贺毒素的大肠杆菌（Shiga toxinproducing E. coli , STEC）[6]。它会在人类肠道中定居，进而引起腹泻、出血性结肠炎，其中一部分受感染的个体，还会患上溶血性尿毒症综合征（Hemolytic uremic syndrome，HUS）[7]。EHEC的主要共生宿主是牛等反刍动物，但人类直接接触牛，或者食用受EHEC污染的牛衍生产品也会被感染[8]。根据世界卫生组织的报告，已经从患有肠胃道疾病的人和动物中分离出超过380种STEC血清型[9]，但是只有一些血清型和人类的肠胃道疾病有关，其中包括以O抗原分型的亚型，可分为O26、O91、O111、O103、O157等血清型[10]，O157:H7是引起肠炎疾病爆发的主要致病菌株。20世纪80年代 EHEC O157:H7在美国被首次发现并分离出来，过去近四十年已在全球各地传播、流行[11]。在以畜牧业为主的欧美国家，牛肉及牛奶等农产品作为EHEC O157:H7的感染源，经常会引起肠胃道疾病的大规模爆发。在美国，每年约有八万人被EHEC O157:H7感染，超过两千例患者住院治疗[12]。在以种植业为主的亚洲国家也有大型爆发案例，1996年EHEC O157:H7在日本大阪暴发，超过一万人感染，其中死亡11人，2000年在中国江苏、安徽等地发生了数起食源性感染O157:H7事件，致使l77人死亡[1314]。由于EHEC O157:H7的感染具有传播性、暴发性、致死性以及使用抗生素治疗会导致更严重病情等特点，对该病原细菌及时有效的研究、防控是我们现在急需着手的问题。
EHEC O157:H7是一类能产生大量志贺毒素（Stx）的大肠杆菌。根据已有的研究，推测出一种EHEC O157:H7发病机理的模型。细菌首先进入胃肠道，转移到其定殖的主要部位并加工出志贺毒素。志贺毒素导致肠道细胞表面定位的核仁素增加[19]。核仁素是表达内膜素的大肠杆菌O157:H7的真核受体[21]。大肠杆菌O157:H7的内膜素与细胞表面核仁素相互作用，为细菌提供了一个初始附着点。一旦细菌通过内膜素和核仁素相互作用与宿主细胞缔合，内膜素就会与宿主细胞中Tir结合[22]。内膜素与 Tir相互作用，再加上其他TTSS效应蛋白的作用，最终导致宿主细胞的细胞骨架重排和特征性A / E病变的形成[11]。志贺毒素也使O157:H7区别于其他大肠杆菌[15]。免疫学中Stx可分为Stx1和Stx2两个亚型；结构上，Stx的基本结构由A、B亚基组成，A亚基非共价结合到B亚基上[16]。根据已有对志贺毒素作用机制的研究发现，Stx的A亚基被弗林蛋白酶切割成A1和A2，A1亚基具有N糖苷酶活性，在核糖体处切割28S rRNA特定的腺嘌呤残基，从而停止蛋白质合成并导致细胞死亡[17]。B亚基则与宿主细胞表面的（Gb3）受体结合，之后Stx才可以借助其进入宿主细胞[18]。Robinson等人证明Stx可以促进EHEC O157:H7粘附于上皮细胞并在体内的肠道定殖，同时他们发现与野生型EHEC O157:H7菌株相比，EHEC O157:H7 stx2突变体对HEp2细胞的粘附程度更小[19]。Mohawk等人在ICF小鼠模型中证实了Stx促进EHEC O157:H7定殖的能力，他们将外源Stx提供给stx2突变型EHEC O157:H7，恢复了该突变体在小鼠肠道中定殖的能力[20]。以上研究均说明了Stx在肠道疾病中起到致病性的作用。

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