目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法1
1.1 实验用品1
1.1.1 实验菌株2
1.1.2 培养基2
1.1.3 主要溶液与试剂2
1.1.4 仪器设备2
1.2 实验过程2
1.2.1 设计引物2
1.2.2 表达碱性蛋白酶宿主和信号肽的选择3
1.2.2.1 多个DNA片段的扩增3
1.2.2.2 DNA琼脂糖电泳4
1.2.2.3 琼脂糖凝胶电泳产物的切胶回收4
1.2.2.4 融合多个DNA片段4
1.2.2.5 制备枯草芽孢杆菌感受态细胞5
1.2.2.6 DNA片段转化至枯草芽孢杆菌感受态细胞5
1.2.2.7 验证转化子5
1.2.2.8 碱性蛋白酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）6
1.2.3 用随机突变高通量筛选表达量提高的转化子6
1.2.3.1 质粒pHCMC05提取6
1.2.3.2 多聚体整合的方法构建表达载体6
1.2.3.3 碱性蛋白酶基因片段的突变6
1.2.3.4 随机突变菌株的构建与筛选6
1.2.4 用自发突变高通量筛选表达量提高的转化子6
1.2.4.1 质粒pUS20D9M的提取7
1.2.4.2 自发突变菌株的构建与筛选7
1.2.4.3 自发突变菌株的诱导培养7
1.2.5 用同义突变高通量筛选表达量提高的转化子7
1.2.5.1 同义突变菌株的构建与筛选7
1.2.5.2 同义突变菌株的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）8
1.2.6 整合到多拷贝质粒上表达碱性蛋白酶8
2 结果与分析8
2.1 碱性蛋白酶宿主和信号肽选择表达8
2.1.1 枯草杆菌碱性蛋 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
白酶基因的整合9
2.1.2 重组菌株蛋白酶活力的检测9
2.1.3 重组菌株碱性蛋白酶活力的SDS—PAGE分析9
2.2 随机突变菌株碱性蛋白酶的表达9
2.2.1 随机突变重组质粒及转化子的鉴定10
2.2.2 随机突变重组菌株蛋白酶活力的检测11
2.3 自发突变菌株碱性蛋白酶的表达12
2.3.1 自发突变重组质粒及转化子的鉴定12
2.3.2 自发突变重组菌株蛋白酶活力的检测12
2.4 同义突变菌株碱性蛋白酶的表达13
2.4.1 同义突变重组质粒及转化子的鉴定13
2.4.2 同义突变重组菌株蛋白酶活力的检测14
2.4.3 同义突变重组菌株碱性蛋白酶的SDS—PAGE分析15
2.5 多拷贝质粒碱性蛋白酶的表达15
2.5.1 多拷贝质粒重组质粒及转化子的鉴定15
2.5.2 重组菌株蛋白酶活力的检测16
3 讨论17
3.1 碱性蛋白酶宿主和信号肽选择表达17
3.2 随机突变菌株碱性蛋白酶的表达17
3.3 自发突变菌株碱性蛋白酶的表达18
3.4 同义突变菌株碱性蛋白酶的表达18
3.5 多拷贝质粒碱性蛋白酶的表达18
致谢19
参考文献19
碱性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达
摘要
碱性蛋白酶是一种在碱性条件下发挥作用的生物催化剂，可以将蛋白质裂解成小分子的肽和氨基酸，在工业生产上有很多应用。拥有极佳外源蛋白表达系统的枯草芽孢杆菌不仅容易培养，还可以实现高产量高质量的需求。本研究选择了由实验室构建PD8、XZ63两个优良的枯草芽孢杆菌为出发菌株，扩增了两个与外源蛋白分泌密切相关的信号肽，分别是碱性蛋白酶的自身信号肽和aprE信号肽，构建两种表达盒插入两种菌株，并通过比较四种重组菌株产生水解圈和SDSPAGE分析的差异，从而推测它们对碱性蛋白酶表达的影响。然后，由先前得到的适配的信号肽碱性蛋白酶基因片段和菌株，进行随机、自发、同义突变获得突变菌株，构建突变文库筛选出表达量提高的菌株。最后，将碱性蛋白酶基因片段与多拷贝质粒载体相连，观察碱性蛋白酶的表达水平有所提高。

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