现代社会抗生素的过度使用，致使抗生素抗性基因和耐药菌（Antibiotic Resistance Genes，ARGs）在环境中广泛存在，对生态系统造成极大的污染风险。ARGs在环境中的过度承载导致很多生物体具有了耐药性，可能会使人类面临“无药可用”的局面。根据ARGs的发展规律，提出“渐变-累积-突变”的ARGs演变模型。由于人们过度使用抗生素，细菌对抗生素的耐药性已由单一耐药逐渐发展为多重耐药性。抗性基因水平基因转移（Horizontal Gene Transfer，HGT）是ARGs传播的主要途径，HGT可通过细菌的可移动遗传元件如接合性质粒、转座子、接合子及基因组等在同种甚至不同种菌株间发生，这加速了ARGs的传播扩散。全世界曾广泛使用有机氯农药对农作物进行消毒杀虫。但是农药对ARGs迁移的影响尚未清晰，本课题的实验目的是探究有机氯农药对大肠杆菌接合效率的影响，以两株具不同抗性的大肠杆菌HB101和JM108为供试菌株，试图明确有机氯农药对抗性质粒通过接合发生水平转移的影响。实验结果显示，β-六六六、o-pDDT和氯丹对大肠杆菌的接合效率呈抑制作用，但是在一定浓度范围内，随着农药浓度的增加，接合效率升高。表明有机氯农药对ARGs在生物体内的转移有一定的影响，为避免耐药菌的扩大污染，需要对残留的有机氯农药进行有效降解。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1．1 实验材料及仪器4
1．2 实验方法4
2 结果与分析6
2．1 有机氯农药对受体菌JM108平板计数结果的影响6
2．2 有机氯农药对大肠杆菌接合效率的影响8
2．3 接合子的形态确认9
3 讨论9
3．1 有机氯农药对受体菌JM108存活率影响的可能性解释9
3．2 有机氯农药对受体菌JM108接合效率影响的可能性解释9
4 结论10
致谢10
参考文献10
图1 RP4质粒的物理与遗传图谱 3
图2 不同浓度有机氯农药对受体菌JM108平板计数结果的影响6 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: *351916072* 

图3 不同浓度有机氯农药对大肠杆菌接合效率的影响7
图4 不同浓度的β六六六、opDDT和氯丹对接合效率的抑制程度（抑制）7
图5 不同农药条件下接合子的质粒电泳图8
图6 接合子中RP4质粒traG基因的PCR结果电泳图8
表1 有机氯农药3
表2 抗生素储备液4
表3 不同农药的浓度设置5
表4 二亲接合及涂布筛选实验滤膜和抗性平板设置5
表5 PCR反应体系6
有机氯农药对大肠杆菌接合效率的影响
引言
引言ARGs是一类决定细胞对某些抑制物或毒性物质具有抗性表现型的基因。这类基因常与质粒相联系，在基因工程技术中，将这些质粒改造为理想的载体，以抗性为标记，选择重组体。作为一类新型污染物，ARGs在环境中持久存在，能够在不同介质及不同生物体中广泛传播，引起了社会人群及科研人员的广泛关注，这已成为一大研究热点[1]。
土壤中ARGs传播的主要诱因为抗生素的选择压力，其次，环境条件如光照、重金属、农药等在其传播过程中发挥着重要作用，土壤生物如蚯蚓、线虫的移动也为其提供有利条件[2]。土壤ARGs及耐药菌污染已成为全球性热点问题，在农田土壤、养殖场、河道底泥都有检测到其存在，有学者调查了京津地区的农田土壤，检测到tetA、sul1及四环素抗性菌等[3]。微生物的传播还可以在基因水平上进行传播，如遗传、基因转移等方式。这种基因转移转移方式可以分为两类，分别是基因垂向转移（Vetical Gene Transfer，VGT）和水平转移（HGT）。VGT是亲代与子代之间，通过繁殖的方式进行基因转移，其传播范围有限。HGT是不同生物个体之间，或单个细胞内部细胞器之间进行的遗传物质的交流。所谓的不同个体可以是同种的但含有不同遗传信息的生物个体也可以是不同种的生物个体[4]。由于HGT可以在同种或不同种属的菌株间发生传递，ARGs的出现几率会大大提高。在一定的环境条件下携带ARGs的裸露DNA将ARGs转移到受体细胞中，而受体细胞中的遗传物质可以通过载体（如质粒）、直接（如接合）或者间接（如转化）的形式进一步转移[5]，实现ARGs的扩散转移。
HGT传播的主要方式包括转化、转导和接合[6]。转化主要是通过质粒或者是细胞死亡之后主动排出的染色体DNA片段，同时还需要一个可以获得细胞外DNA的受体和受体宿主细胞的DNA修复酶（重组酶），通过同源重组或者异源重组的方式完成转化过程。转导是一类通过噬菌体来完成基因转移的过程，一种是噬菌体在宿主体内进行自我复制的过程中携带宿主体内的DNA，然后将其遗传物质再释放到新的宿主体内。另一种是将噬菌体吸附位点附近的DNA转移到新的宿主体内。接合是供体菌与受体菌通过抗性菌毛形成连接通道，DNA片段通过这个通道进入到受体菌体内[7]。本次实验采用第三种二亲接合的方式，来研究有机氯农药对大肠杆菌接合效率的影响。
国内外学者对地下水、地表水、污水处理厂废水、饮用水中的ARGs的含量已经展开了大量的研究。其中我国检测到ARGs的水域有黄河、珠江、黄浦江、海河流域。Lin等在对长江入海口及沿海沉积物研究过程中，检测到sul类、tet类、intI基因，含量从海岸到河口呈上升的趋势[8]。Jiang等在对黄浦江流域和流域内饮用水水源地的研究发现，黄浦江流域的其他地区的ARGs含量低于水源地的ARGs含量[9]。Zhu等在河北、天津、福建、广东、广西、浙江、辽宁的共18个河口沉积物中检测到85~158种ARGs[10]。江月等对夏季的长江下游某水源型水库进行调查，检测到ARGs有118种，和我国其他地区相比较处于中等水平[11]。从以上调查可以看出我国的ARGs污染形势极其严峻。
有机氯农药（Organochlorine pesticides，OCPs）对害虫具有很强的杀伤效果，曾在全球农业上大量使用[12]，在《斯德哥尔摩公约》优先控制污染种类占的比例最大。作为一类持久性有机污染物，有机氯农药化学性质稳定，脂溶性高，难以自然降解及去除，具有较高生物毒性和远距离迁移能力，在土壤和水体环境中长期存在，可通过直接或间接的方式进入人体内，引发人群健康危机。从原料来源划分，有机氯农药可分为两大类，分别以苯和以环戊二烯为原料，前者主要有HCHs、DDTs和六氯苯等，后者主要有氯丹、七氯、异艾氏剂、艾氏剂、狄氏剂等。有学者曾对微山湖的水质进行调查，发现微山湖的生物体内六六六、DDT的检出率为100%，沿湖的一公里范围内地下水受污染深度达20米，造成9万多人的饮水健康受到威胁[13]。张祖麟等在厦门港表层水检测出16种有机氯农药[14, 15]。张秋菊等对新疆的地下水调查发现，在英吉沙县和莎车县一些村庄的地下水均检测出六六六、功夫菊醋、敌敌畏、敌百虫、甲拌磷[16]。2010年在上海市城区土壤中六氯苯、氯丹、HCHs及DDTs的检出率相当高，为69%100%[17]。
由于从环境中获得并积累ARGs，更多细菌具有了耐药性。针对ARGs的产生，有学者根据ARGs及耐药菌的产生及传播提出“渐变累积突变”的ARGs演变模型；抗生素的大量滥用会对环境中微生物产生选择压力，进一步使菌体产生耐药性，不断积累ARGs，获得多重耐药性，或有可能突变为超级细菌[18]。

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