目前，由胶孢炭疽病菌引起的辣椒炭疽病广泛流行，给辣椒产区带来巨大的经济损失。目前，辣椒炭疽病菌主要用麦角甾醇脱甲基化抑制剂（DMIs,如戊唑醇和苯醚甲环唑）防治。本研究共从江苏盐城辣椒产地的患病辣椒中分离出8株胶孢炭疽菌，其余皆为尖孢炭疽菌。这8株胶孢炭疽病菌中，采用鉴别剂量10ug/ml戊唑醇测定结果表明有2株敏感菌株和6株抗性菌株。经过对抗性/敏感菌株的CYP51A 和CYP51B 基因测序和比对分析，发现共存在三种突变类型类型I(仅在CYP51A上存在4个氨基酸密码子点突变:V18L、L58V、S175P 和P341A)除了产胞能力高于敏感菌株外，其他方面（生长速率，孢子萌发速率和致病能力）均弱于敏感菌株；类型II(在CYP51A上存在5个氨基酸密码子点突变:L58V、S175P、A340S、T379A 和N476T, 同时在CYP51B上存在3个氨基酸密码子点突变:D121N、T132A和F391Y)的适应度与敏感菌株差异不显著；类型III(在CYP51A上存在2个氨基酸密码子点突变:L58V和S175P, 同时在CYP51B上存在1个氨基酸密码子点突变:T262A)除了致病能力强于敏感菌株外，其他方面也弱于敏感菌株。交互抗性测定结果表明DMIs杀菌剂之间存在正交互抗性；分子对接结果表明抗性菌株的CYP51A或CYP51B蛋白与戊唑醇的亲和力均低于敏感菌株。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1 材料与方法3
辣椒炭疽菌分离 3
杀菌剂 4
培养基 4
1.2 方法 4
1.2.1 胶孢炭疽病菌对戊唑醇敏感性类型4
1.2.2 胶孢炭疽病菌对戊唑醇抗药性菌株生物学性质4
1.2.3 致病性测试4
1.2.4交互抗性4
1.2.5胶孢炭疽病菌抗药性菌株上游基因和CgCYP51基因的克隆和测序4
1.2.6 胶孢炭疽病菌抗药性菌株CgCYP51基因的定量表达5
1.2.7分子对接分析5
2 结果与分析5
2.1 结果与数据分析5
2. *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
1.1胶孢炭疽病菌对戊唑醇敏感性类型 5
2.1.2胶孢炭疽病菌对戊唑醇抗药性菌株生物学性质5
2.1.3交互抗性6
2.1.4胶孢炭疽病菌抗药性菌株CgCYP51基因的序列分析及定量表达6
2.1.5胶孢炭疽病菌抗药性菌株CgCYP51蛋白与戊唑醇的亲和力分析7
3 讨论 8
3.1 对戊唑醇的抗性8
3.2 交互抗性8
致谢8
参考文献8
辣椒炭疽病菌对戊唑醇抗药性生物学性质研究
引言
辣椒是世界上最受欢迎的作物之一，因为它需求量大、营养和商业价值高[1]。辣椒喜欢生长在热带和亚热带地区，如亚热带美洲[2][3]和热带亚洲[4]。炭疽病是辣椒产业最重要病害之一[5][6]。炭疽病菌可以引起460种木质和草本植物炭疽疾病[7],例如葡萄熟腐病[8]和草莓炭疽病[9],西瓜炭疽病[10],苹果和梨的炭疽病[11],辣椒炭疽病[7]和其他重要经济作物的病害[12]。许多报道表明，不同种类的炭疽病菌可以同时寄生在同一寄主上，如辣椒、葡萄、草莓等；并且同一种炭疽菌也可以寄生在不同寄主上。据悉有三种炭疽病菌在辣椒上被发现包括：Colletotrichum gloeosporioides sensu stricto[13]，C. acutatum 和C. coccodes[5][14]，葡萄炭疽病菌包括C. gloeosporioides sst. 和 Colletotrichum acutatum[15]；草莓上存在三种炭疽病菌:C. acutatum [16]， C. gloeosporioides sst. .[17]和C. fragariae [18][19]；此外C. orbiculare [20] 和C. lagenarium [21]这两种病菌可引起西瓜炭疽病。
在江苏省盐城市，C. Gloeosporioides sst是辣椒等多种作物病害的致病菌[1][2][3]。目前，防治炭疽病最有效的方法还是化学防治。常用的控制辣椒炭疽病的杀菌剂：苯并咪唑类杀菌剂(如多菌灵)、泛醌外抑制剂（如嘧菌酯）和 琥珀酸脱氢酶抑制剂（如啶酰菌胺）[22][23][24]。但已有报道，炭疽病菌对上述杀真菌剂产生了抗药性[25][26][27]。另外一种主要的杀菌剂是去甲基化抑制剂杀菌剂(DMIs)，包括咪唑类杀菌剂和三唑类杀菌剂(如戊唑醇、苯醚甲环唑、丙环唑等)。DMIs通过与菌体甾醇14去甲基化酶(CYP51)的血红素铁相互作用，抑制真菌生长；能够在植物被真菌感染后，有效控制病害[7]。然而，近年来已有报道：一些植物病原真菌对DMI杀菌剂具有抗药性[28][29][30][31][32]。迄今为止，唑类抗性机制共三种:（1） CYP51点突变，降低其与药剂间亲和力[33][34][35][36][37][38]；（2）CYP51基因增量表达；（3）编码药物外排泵的基因过量表达，如ATP结合盒转运蛋白，它能够将抑制剂转运出细胞[39][40][41]。
在本研究中，对采用鉴别剂量10ug/mg测定了C. gloeosporioides sst 对戊唑醇的测定，发现存在田间抗药性菌株！因此，拟(1)确定C. gloeosporioides sst.对戊唑醇的敏感性；(2)研究抗药性菌株的生物学性质；(3)明确其与其他DMIs交叉抗性模式；(4) 可能的抗药性分子机制。
1 材料与方法
1．1 辣椒炭疽病菌菌株分离、供试药剂和培养基
1．1．1辣椒炭疽菌分离
于2018年夏天从江苏省盐城采集了因辣椒炭疽病病果。从果实表面病变部位和健康部位的交界处切下小块组织，先用1% NaClO消毒3min，再用75%乙醇消毒，然后用无菌水冲洗3次，最后置于添加了硫酸链霉素的PDA平板上，在黑暗中25℃培养。4天后，从菌落边缘切下一小块正方形菌丝块，转移到新的PDA平板上。将每一株分离后的菌株在暗室中培养7天，再在黑暗中培养25天后，制备孢子悬浮液，并加入一滴吐温20，涂平板后，在显微镜下挑出一个分生孢子，移到添加了硫酸链霉素的新鲜PDA平板上。一共获得78株单分生孢子炭疽病菌菌株，并将其保存在4℃的PDA斜板上。采用CTAB法从每个菌丝中提取DNA [42]。利用种特异性引物ITS1和ITS4一共鉴定出8株C. gloeosporioides sst.菌株,其余均为C. acutatum，并用于后续研究。
1．1．2 杀菌剂
杀菌剂包括：戊唑醇(95% a.i.)、苯醚甲环唑(96.5% a.i.)、丙环唑(98% a.i.)、嘧菌酯(96% a.i.)，水杨酸(SHAM) (99% a.i.)。戊唑醇、苯醚甲环唑、丙环唑和水杨酸利用甲醇制备10000µg /ml的母液；嘧菌酯是溶解于丙酮，制成10000µg /ml母液，4℃保存，备用。
1．1．3 培养基

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