轮枝镰孢菌（Fusarium verticillioide）是一种非常重要的植物病原真菌，可以引起玉米的苗枯病及玉米穗腐病等，导致粮食作物大量减产，继而给农民带来巨大的经济损失。前期研究发现在轮枝镰孢菌中转录因子FvSwi4和FvSwi6调控了许多基因的表达，如调控细胞分裂的相关基因，与脂质合成有关的基因，与几丁质酶合成相关的基因等，本研究通过Western Blot、同源重组法基因敲除等技术发现FvSwi4和FvSwi6调控组蛋白H3K9和H3K36的三甲基化修饰，进一步通过EMSA验证转录因子FvSwi4、FvSwi6对下游靶基因的直接调控作用，研究结果为轮枝镰孢菌所引起玉米病害的防治提供理论基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1.相关背景概念 2
2.关于bHLH类转录因子研究进展 3
3.关于组蛋白甲基化研究进展 3
一．蛋白印迹法（Western blot）实验 5
1.实验材料 5
1.1供试菌株 5
2.实验方法 5
2.1 轮枝镰孢的保存、培养及产孢方法 5
2.2 轮枝镰孢蛋白的提取 5
2.3 浓缩胶和分离胶的制作 5
2.4 上样与电泳的方法 6
2.5 转膜的方法 6
2.6 封闭的方法 6
2.7 孵育的方法 6
2.8 曝光的方法 6
3.结果与分析 7
二．凝胶迁移（EMSA）实验 7
1.实验材料 7
1.1供试菌株 7
2.实验方法 7
2.1探针的制备 7
2.2载体的构建 8
2.3蛋白的纯化 9
2.4 EMSA结合反应 10
2.5 EB电泳凝胶的制作 10
2.6 上样与电泳的方法 10
2.7 曝光的方法 10
3.结果与分析 10
3.1探针的制备 10
3.2载体 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
的构建 11
3.3蛋白的纯化 13
3.4 EMSA电泳结果 14
分析与讨论 14
致谢 15
参考文献 15
附录 17轮枝镰孢菌转录因子FvSwi4和FvSwi6调控组蛋白H3K9和H3K36甲基化机制的研究
引言
1.相关背景概念
1.1轮枝镰孢的分类学地位
镰孢菌(Fusarium spp.)是一类非常重要的植物病原菌，属于丝状真菌类。镰孢菌的种类极其繁多，目前已发现的镰孢菌包括44种与7个亚种，其分布也十分广泛，普遍存在于动植物有机体上及土壤中，也可在极端环境中生存，如北极地区的低温和沙漠地区的高温干燥的环境，属于腐生或半寄生的生活方式。轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)在分类地位上属于无性真菌类，丝孢纲，瘤座孢目，瘤座孢科，镰孢属。
1.2轮枝镰孢的生物学特征
轮枝镰孢的无性世代中极少产生大型分生孢子，大多形成小型分生孢子，大部分串生于具分支分生孢子梗的单瓶梗上，有的也以假头状产生于单瓶梗上，呈卵形或棍棒形，长度为5.012.0μm，宽度为1.22.5μm。大型分生孢子长度为31.058.0μm，宽度为2.73.6μm产孢细胞通常“V”形成对或呈“兔子耳朵”状，不产生厚垣孢子。该菌的营养组织为二叉状分枝的线状菌丝，这些线状菌丝聚集在一起组成了菌丝体。在PDA培养基上生长时，初期为白色卷毛状菌丝，随着培养时间的延长，白色菌丝颜色逐渐变深，呈牵牛花紫色，最后接近于黑色。但是在CM培养基上生长时，产生的气生菌丝较多，菌丝颜色不会随着培养时间的延长而变紫，而是自始至终为白色。轮枝镰孢在15℃35℃均可生长，最适生长温度为25℃，最适产孢温度为35℃，致死温度为70℃。菌丝最适扩展pH为8.0，产胞最适pH为7.0。
1.3轮枝镰孢危害
轮枝镰孢是一种常见的致病菌，会造成多种植物的茎、穗腐烂，尤其是对玉米的危害极其严重，是玉米茎、穗腐病的优势种群。轮枝镰孢的侵染分为三个阶段：侵入期，该阶段病菌已侵入植株，其生活形式通常是活体营养型；无症期，该阶段是一个相对较长的时期，不会对寄主造成实质性的损害，且真菌毒素在这一阶段的产生量较低；发病期，该阶段的病菌会大量繁殖，若是幼苗被侵染则在发病2至3周内死亡，病变植物叶片为灰绿色，然后变黄，果肉分解，茎干易倒伏。
1.4 bHLH结构域及bHLH类转录因子
在许多真核生物中，bHLH结构域是一类必需的DNA结合区域，且该结构域高度保守。许多细胞内重要的信号的转导过程都离不开该结构域的参与，包括：分化，代谢和对外界不同环境状况的反应[1]。在动植物、真菌的基因组中，bHLH类转录因子形成了一个庞大的体系。通过分析这些转录因子，发现bHLH结构域的进化过程是高度保守的，几乎没有序列与基本序列存在差异[2]。bHLH结构域包含的氨基酸数约为60个，其组成主要包括两个部分，一个碱性区域(Basic region)和一个二聚化区域(Dimerization regions)。碱性区域N端的13个氨基酸负责与DNA之间的互作，一般包括56个碱性残基，这些碱性残基使得转录因子与DNA更容易结合。很多bHLH结构域会与一类被称为Ebox(CANNTG)的六聚体核苷酸序列结合[3]。二聚化区域包括由一个环分开的两个不同长度的α螺旋，这些α螺旋会与次级的同源或异源二聚体结合从而促进转录[4]。
1.5转录因子FvSwi4和FvSwi6
1977年Haber J.E.等鉴定了一系列酵母交配型(Matingtype)转化相关的一些基因，命名为SWI基因(源于Switch)。其中基因Swi4与Swi6发挥着重要的作用。酿酒酵母中的Swi4含1093个氨基酸，Swi6包括803个氨基酸，两者都含有Ankyrin结构域和KilAN结构域。Ankyrin结构域包括由环分隔的两个α螺旋，主要在蛋白质的互作中起作用[5]。另外一个KilAN结构域，与真菌中APES结构域同源，该结构域的中心区域是一个典型的bHLH结构，是bHLH大家庭中的重要成员，能结合DNA上特殊的保守序列[6]。
在酵母中，Swi4基因编码一个必需的转录因子，HO内切核酸酶的表达与细胞间期的G1时期的形成都需要该转录因子的调控[7]。Swi4与Swi6形成一个SBF复合体，与 SCB(Swi4/Swi6dependent cell cycle box：CGCGAAA)结合。在调控细胞从G1时期发展到S期时，首先酵母中的Cdk(Cyclindependent kinase)与Cdc28相结合形成复合体，该复合体磷酸化并抑制Whi5，在解除Whi5对SBF复合体的抑制后，SBF复合体通过与在HO、CLN1、CLN2和 HCS26 基因的启动子上存在的SCB相结合，激活对应的表达，从而调控细胞从G1时期发展到S期[8]。

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