水稻是世界上重要的粮食作物之一，全世界1/2以上的人口将稻米作为主食。由稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是影响稻米产量和品质的主要病害，目前对于稻瘟病的防治主要依赖于化学防治，而大面积的使用化学农药不但会增加生产成本，而且容易造成严重的环境污染。近年来的深入研究发现，水稻-稻瘟病菌互作时，病菌分泌的多种效应因子在其侵染水稻时具有重要的作用。实验室前期研究发现，MoSwa2作为一个重要的囊泡转运蛋白，调控稻瘟病菌的外泌和致病过程。为了揭示MoSwa2如何调控稻瘟病菌致病性，我们通过质谱鉴定MoSwa2调控的胞外蛋白，发现其中一个与活性氧(reactive oxygen species, ROS)代谢相关抗坏血酸过氧化酶MoApx。进一步构建了MoAPX基因的敲除载体，并根据同源重组的原理在稻瘟病菌Guy11菌株内成功地敲除该基因。致病力测定发现MoAPX敲除后致病力显著下降。为了解释其致病力下降的原因，我们筛选其在水稻中的互作蛋白，并采用免疫共沉淀和双分子荧光互补的方法进行一对一互作验证，为后续揭示稻瘟病菌外泌蛋白MoApx调控稻瘟病菌致病力的机制奠定了良好基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1研究采用的菌株3
1.1.2研究采用的培养基3
1.1.3研究采用的试剂3
1.2方法 3
1.2.1设计引物3
1.2.2扩增片段3
1.2.3 TA克隆4
1.2.4酶切回收4
1.2.5原生质体的制备4
1.2.6原生质体的转化4
1.2.7转化子转板5
1.2.8转化子粗提验证5
1.2.9转化子精提验证5
1.2.10敲除突变体的致病性分析6
1.2.11回补载体致病性分析6
1.2.12 MoApx1潜在互作蛋白筛选6
1.2.13 CoIP实验对互作蛋白进行一对一验证7
1.2.14水稻原生 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
质体转化7
1.2.15 BiFC实验对互作蛋白进行一对一验证7
2结果与分析8
2.1敲除转化子的获取8
2.1.1 PCR扩增回收的上下臂8
2.1.2 TA克隆菌落PCR验证8
2.1.3重组质粒菌落PCR验证9
2.1.4 MoAPX1基因敲除转化子的筛选和验证10
2.2稻瘟病菌效应因子MoApx1参与调控稻瘟病菌致病性11
2.3 CoIP一对一验证MoApx1与互作蛋白间的互作12
2.4 BiFC一对一验证MoApx1与互作蛋白间的互作12
3讨论 13
3.1结果讨论 13
3.2研究中遇到的问题和解决方法 14
3.3未来展望 14
致谢15
参考文献15
稻瘟病菌外泌蛋白MoApx的功能研究及互作蛋白鉴定
引言
引言
水稻是世界上重要的粮食作物之一，全世界1/2以上的人口将稻米作为主食。然而，近年来由稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病经常发生[1]。稻瘟病爆发的时候会导致水稻大量枯死，严重影响了稻米产量和品质，对粮食生产造成重大的经济损失[2]。据报道，每年稻瘟病都会造成水稻减产10%30%，受灾粮食总数足够供养6000万人口[3]。随着城市化进程不断加快，耕地面积的不断减少，同时病虫害防治难度的增加，对目前水稻培育工作提出了更高的要求[4]。
稻瘟病菌的侵染方式主要是从叶茎表皮和根部侵染水稻，进而形成病斑，其侵染过程可分为以下几个阶段：1）孢子附着到寄主表皮；2）芽管发育；3）形成附着胞；4）产生侵入钉；5）在寄主植物中生长[56]。
在自然界里，植物在生长发育过程中长期暴露在充满来自于昆虫、病毒、细菌、真菌和卵菌等带来的各种威胁，这些威胁可以直接影响植物的生存以及作物的产量。它们与植物之间的互作是非常复杂多样的。植物在面对来自于自然界的威胁时，需要启动防御系统来抵抗外界入侵。与动物不同的是，植物没有动物体内可移动的免疫细胞和适应性免疫系统[7]。
作为防御，植物一般依赖于两个层次的防御系统来抵抗外来病原菌的入侵。病原菌和植物互作ZigZag模型[8]，它很好描述了植物与病原菌协同进化的过程。植物细胞表面的模式识别受体可以对病原物相关分子模式进行识别从而激活模式诱导免疫（PTI）诱导活性氧的迸发从而抑制病原菌的侵染，而病原菌为了能够继续有效的侵染植物，会向寄主植物分泌效应分子来抑制植物的PTI反应。在进化过程中，植物也可利用一些蛋白受体对来自病原菌的效应分子进行特异性识别，病原菌不断的通过对效应子序列突变等手段来逃避寄主免疫系统的识别，同样进化压力也迫使寄主不断更新受体等免疫屏障来识别病原菌，并通过更强烈更快速的免疫反应（ETI）来抵御病原菌的侵染。
病原菌的效应因子是病原菌分泌且在互作过程中能被寄主识别的一种病原体蛋白质以及改变宿主细胞结构和功能的小分子，能操纵寄主细胞结构和功能以利于病原菌侵染和抑制寄主免疫反应[9]。
根据效应分子的定位，可以将其划分为两种不同类型，即细胞质效应分子和质外体效应分子[10]。细胞质效应分子包括，AvrPita、AvrPizt、Pwl1、Pwl2、Pwl3、Pwl4等。通过对AvrPita的研究，Singh等人研究发现等位基因的突变是稻瘟病菌对抗植物免疫系统过程中随之进化的一种常见机制[11]。而AvrPizt是水稻R蛋白Pizt的同源Avr效应蛋白，半胱氨酸对其蛋白功能的表达是至关重要的[12]。
质外体效应分子，例如Bas4和Slp1等。Slp1是稻瘟病菌中典型的有毒效应蛋白，Chen等人在Yoshida等的研究基础上发现它还能抑制包括产生活性氧(ROS)和防御相关基因的几丁质诱导的植物免疫反应从而扰乱植物的免疫系统，降低植物免疫力，提高稻瘟病菌的致病力[13]。鉴于蛋白分子量的大小是决定效应蛋白在细胞内移动的重要条件，Bas4被选作为进一步研究新型稻瘟病菌效应因子功能和定位的参照蛋白[14]。
水稻在生长过程中会响应着一系列的胁迫，而这些胁迫能够促使水稻细胞内活性氧(ROS)水平不断的上升，低浓度的活性氧能够作为信号分子传递给下游，激活信号通路来对外界环境胁迫进行应答，而高浓度的活性氧会氧化水稻细胞内的一些蛋白，使机体受到损伤，对于水稻细胞来说是不利的，所以水稻在进化过程中具有自身的酶促和非酶促系统来清除这种体内的高浓度活性氧，从而维持细胞内的氧化还原系统的平衡，而在这一过程中抗坏血酸过氧化物酶APX（Ascorbate peroxidase）起着非常重要的作用，它可通过利用细胞内的还原性抗坏血酸作为电子供体与过氧化氢反应，从而使过氧化氢被还原为水和氧气，进而降低水稻细胞内活性氧的含量，保证细胞的正常生长[15]。

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