稻瘟病是水稻生产上重要的病害之一，威胁着全世界的粮食安全。稻瘟病菌是一种丝状真菌，它的细胞中膜细胞器之间的交流主要是通过囊泡运输实现的。酵母中的辅助因子蛋白Swa2q可以参与调控网格蛋白包被囊泡的解聚以及网格蛋白骨架的重新装配。在前期研究中又发现稻瘟病菌中含有与酵母Swa2q同源的辅助因子蛋白MoSwa2。该蛋白调控囊泡运输，影响效应分子分泌，进而抑制寄主的防卫反应，并促进侵染菌丝的扩展。本文主要通过免疫共沉淀的方法筛选MoSwa2的互作蛋白，并成功筛选到一个互作蛋白MoSec24-2。进一步通过酶切连接的方法构建了该基因的敲除载体，并利用同源重组的方法在稻瘟病菌体内成功敲除MoSEC24-2基因，获得敲除突变体。从而为解析MoSwa2调控胞吞及效应因子外泌的机制奠定良好基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料2
实验菌株2
实验试剂2
主要实验仪器2
培养条件3
1.2 实验方法3
1.2.1 MoSwa2互作蛋白的鉴定3
1.2.2 敲除载体的构建及其突变体的获得5
2结果与分析6
2.1MoSwa2与MoSec242存在互作6
2.2利用同源重组技术获得MoSEC242敲除突变体7
3讨论及展望 9
致谢9
参考文献9
稻瘟病菌Auxilinlike蛋白MoSwa2的互作蛋白鉴定
引言
水稻作为我国的重要粮食作物，经常会受到水稻三大病害之一稻瘟病的危害。稻瘟病主要为害水稻及其它植物的地上部分，该病的发生会引起作物的大幅度减产，且该病在我国各个地区均有发生。我国每年因该病而造成的减产大约可以达到10亿千克左右【1】。虽然目前的情况是我们可以通过化学防治等方法对其进行防治，但都不算是长期之策，这就使关于稻瘟病菌及其致病机理方向的研究变得十分重要。
稻瘟病是一种真菌性病害，稻瘟病菌是属于子囊菌纲的真菌。在田间的稻瘟病菌主要是以无性态的稻梨孢进行侵染。成熟 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
的分生孢子通过风雨传播的方法落到水稻的叶片上，并在顶端分泌出孢尖黏液以使其能够牢固的附着在水稻叶片上。分生孢子可以通过识别外界信号，如寄主叶片的疏水性或者硬度等。并在合适的温度及湿度条件下萌发产生稻瘟病菌侵染水稻至关重要的附着胞。当附着胞内积聚了极大的膨压之后，附着胞就会在与水稻叶片接触面上的actin环处形成侵染钉，进而侵入水稻叶片表皮【2】。
不管是稻瘟病菌的生长发育还是其的侵染过程都始终离不开自身内部的物质运输的过程。作为真菌，它的细胞中含有许多由膜构成的细胞器，膜细胞器之间不断进行着物质运输以维持其的正常生理状态。这些物质运输，尤其是蛋白质的运输主要就是通过囊泡进行的。而囊泡属于真核细胞中的一种十分常见的膜泡结构。它虽然不是作为一种细胞固有的结构存在，但仍然算是细胞内膜系统中不可缺少的重要功能结构组成以及细胞内物质定向运输的载体和表现形式【3】。囊泡的运输过程通常涉及到囊泡从前体膜上形成，转运以及与靶标膜的融合过程【4】。而除此之外，真核细胞的胞吞和外泌途径的形成的基础就是与胞吞和外泌相关的囊泡的转运。由此，不难看出囊泡对于维持细胞内动态平衡的重要性。不仅如此，其对于细胞极性生长，菌丝生长和真菌毒性都有着至关重要的作用【5】。
真菌细胞中对于囊泡运输的调控机制是十分复杂的。不仅是由于细胞内有着多种多样的细胞器；而且，囊泡的形成和融合还受到了许多不同蛋白复合体的调控。通过查阅文献我们了解到酵母中的辅助因子蛋白Swa2q与伴侣蛋白Hsc70共同调控着网格蛋白包被囊泡的解聚以及网格蛋白骨架的重新装配【6】【7】【8】。实验室前期在稻瘟病菌的研究中我们发现了一个与酵母Swa2q同源的辅助因子蛋白MoSwa2，其参与抑制寄主的防卫反应，并促进侵染菌丝的扩展。经前期研究发现，辅助因子MoSwa2不仅参与抑制寄主防卫反应并增强稻瘟病菌致病力的过程，还在胞吞和胞外蛋白的外泌过程也有重要作用。
MoSwa2定位于囊泡上，其对稻瘟病菌的致病力有着积极地作用。在稻瘟病菌与寄主水稻互作的前期，稻瘟病菌是缺乏营养的。也正是在这种饥饿胁迫的状态之下，稻瘟病菌会分泌大量的效应分子蛋白进入到寄主水稻中从而实现侵染【9】。通常情况下，稻瘟病菌会激发寄主水稻的两种防卫反应【10】。这个过程首先是水稻识别PAMPs之后触发PTI，随后稻瘟病菌会分泌大量效应分子以干扰植物的PTI；接着，效应分子又会被寄主水稻的R蛋白识别并触发ETI。而MoSwa2可以从两个方面影响这个过程。一方面，MoSwa2可以通过影响效应分子AvrPia的分泌，从而抑制寄主的PTI【11】【14】。并且在稻瘟病菌诱发寄主水稻产生防卫反应的过程中，寄主体内通常会伴随有大量ROS的产生。MoSwa2蛋白可以通过抑制植物体内ROS信号通路去抑制 ROS的生成 ，进而抑制寄主水稻的防卫反应并促进病菌侵染菌丝的生长【15】。另一方面，它对细胞的外泌和胞吞过程均有着一定的调控作用。其可以调控一些抑制寄主免疫反应的胞外蛋白分泌到寄主内来帮助病菌抑制寄主免疫反应。
综上所述，我们可以发现MoSwa2在很多囊泡运输的过程中都有着重要的作用。通过调控效应分子和大量胞外蛋白的分泌，抑制寄主的防卫反应，但MoSwa2是如何影响胞吞及效应因子的外泌过程的机制尚不清楚。在本实验中我们通过筛选到MoSwa2的互作蛋白MoSec242，并对其功能进行研究从而为解析MoSwa2调控胞吞及效应因子外泌的机制提供理论基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 实验菌株及保存方法
本实验所使用的所有野生型菌株Guy11均是由实验室保存的。ΔMoSec242突变体菌株是由实验获得的。
1．1．2 实验试剂
CM培养基（1L）：
20x Nitrate Salts（氮盐） 50ml
Trace Elements（微量元素） 1ml
DGlucose（葡萄糖） 10g

原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/zwbh/564115.html