3水稻是人类重要食物来源，但是水稻害虫一直危害着水稻的生长发育，并严重的降低了水稻产量。在农田生态系统中，蜘蛛是农作物害虫的重要捕食性天敌，其中拟环纹豹蛛（Pardosa pseudoannulata）是农田蜘蛛中的重要优势种群之一。乙酰胆碱酯酶是神经递质乙酰胆碱水解所需要的关键酶，同时也可参与细胞的发育和成熟，能够促进神经元的发育和神经的再生等。已有的研究发现，拟环纹豹蛛中有5个编码乙酰胆碱酯酶的基因。本文在拟环纹豹蛛中克隆获得了3个新的乙酰胆碱酯酶基因。序列比对和系统进化分析结果表明，拟环纹豹蛛8个乙酰胆碱酯酶的部分关键功能位存在差异，预示着它们可能出现了功能分化。本文利用荧光定量PCR技术检测了8个乙酰胆碱酯酶基因在不同组织中的表达差异，对于进一步探究其功能，保护和利用天敌具有重要意义。
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引言
引言
乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）是神经递质乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）水解过程中所需要的重要丝氨酸水解酶，在绝大多数动物的突触传递过程中起着至关重要的作用[2]。自从1991年电鳐（Torpedo californica）的AChE（TcAChE）晶体结构被解析后[3]，人们对昆虫及哺乳动物的AChE进行研究，并发现了与其功能相关的活性位点，如：催化三联体、酰基口袋、外周阴离子位点等。其中，由S200（Ser200）、H440（His440）和E327（Glu327）组成的催化三联体，是AChE与抑制剂结合的主要部位[5]。外周阴离子位点[6]（peripheral anionic site，PAS）由一些带负电荷的氨基酸组成。酰基口袋由两个苯丙氨酸的残基构成[3]。氧阴离子洞[5]由残基主链氮原子与羰基氧，以及酯键的氧与咪唑基相互作用共同构成。
AChE是氨基甲酸酯类以及有机磷类杀虫剂的分子靶标，与位于AChE活性中心上的丝氨酸残基相结合，可钝化酯酶的活性，使ACh在突触处长期的积累，造成昆虫长期过度兴奋，从而阻断神经冲动的传导去极化，导致昆虫生理生化功能失调和破坏[810]。在具有两个或两个以上AChE的昆虫中，AChE1是大多数物种的主要催化酶[2327]，且大多的突变主要发生在AChE1上。ace1的突变是对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
剂产生抗性的主要机制[1112]。如，烟粉虱（Bemisia tabaci）和三带喙库蚊（Culex tritaeniorhynchus）AChE1的F392W突变导致其对于有机磷类的杀虫剂不敏感[13]，A216S突变增加了绿盲蝽对毒死蜱的抗药性[14]，几种蚊虫G119S的突变导致对其杀虫剂变得不敏感[15]。除了这些单个的突变外，AChE1的多个位点的突变也被证实了可以增加其对杀虫剂的抗性。例如，突变G119S、F331C和I332L共同作用，不仅导致褐飞虱（Nilaparvata lugens）对毒死蜱产生高水平的抗性，而且能够降低单一突变造成的适合度代价[16]。
AChE除水解神经递质的催化功能外，还具有与神经冲动传递无关的非催化功能。在哺乳动物中，AChE能够促进调节突触形成和功能、引起神经突触长度的增加[1718]。关于昆虫的AChE非催化性功能的研究相对较少，然而有研究发现当AChE被抑制表达后，昆虫出现发育迟缓、产卵及孵化率降低、体重减轻等现象[19]。在赤拟谷盗（Tribolium castaneum Herbst）中，TcAChE2的沉默延缓了昆虫的发育，减少了雌性产卵和孵化，表明TcAChE2可能参与了雌性生殖及胚胎和后代发育[20]。在蝗虫中，乙酰胆碱酯酶活性是在胚胎发育过程中神经突触发生前检测到的，也支持乙酰胆碱酯酶在胚胎发生中的非胆碱能代谢功能[21]。
拟环纹豹蛛（Pardosa pseudoannulata）是水稻天敌中适应性极强的一种生物，体型较大，空间生态位宽，具有很强的环境适应能力，尤其是在南方稻作区[1]。已有的研究发现，拟环纹豹蛛中有5个编码乙酰胆碱酯酶的基因[2930]。本文在拟环纹豹蛛中克隆获得了3个新的乙酰胆碱酯酶基因，将其命名为：Pp1208.3、Pp1101.1、Pp1387.5。通过序列比对和系统进化分析，比较了8个拟环纹豹蛛乙酰胆碱酯酶关键功能位点的差异；利用荧光定量PCR技术检测了8个乙酰胆碱酯酶基因在不同组织中的表达差异。该研究将为蜘蛛AChE基因多样性、进化、昆虫与天敌蜘蛛之间的杀虫剂靶点选择机制，以及害虫综合治理提供重要信息。
1 材料与方法
1．1 供试材料
采集拟环纹豹蛛雌成蛛，解剖获得各个部位的组织样品。
1．1．1 拟环纹豹蛛雌成蛛的采集
在2018年9月初，于江苏省南京市大学江浦试验站的水稻田采集，蜘蛛置于室内培养箱中饲养。温度26±1 ℃，湿度7080%，光照：暗光照为14：10 h。
1．1．2 实验组织的解剖
经酒精麻醉12 min后，解剖采集的拟环纹豹蛛雌成蛛，获得各个组织，包括有：脂肪体、脑、毒腺、触肢、肠道、卵巢和足。各组织样品用液氮速冻后，保存于80 ℃冰箱，以便后期实验应用。
1．2 主要试剂
RNA提取所用到反转录试剂盒PrimerScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit为TaKaRa公司产品；克隆载体为北京全式金公司的产品（PeasyBlunt Cloning Kit）；胶回收试剂盒（GeneJET Gel Extraction Kit）为Thermo Fisher公司的产品；Trizol购于Invitrogen公司（Burlington，Canada）；SYBR® Premix Ex TaqTM II购于TaKaRa公司（TaKaRa，Tokyo，Japan）。
1．3 实验方法
1．3．1 RNA的提取（Total RNA方法）
实验仪器：匀浆器、离心管（1.5 mL）酒精灯、镊子、移液器（1000、200、10、2.5 μl）的枪头、废液缸、液氮罐、冰盒、一次性手套、记号笔、离心管架、塑料杯。
实验试剂：Trizol 试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC水。
用Trizol Reagent提取总 RNA 操作步骤如下：
（1）将50100 mg左右组织放入匀浆器内，加入1 mL Trizo1试剂裂解细胞，再转移至新的1.5 mL离心管中。
（2）28 ℃，12000×g离心15 min后，将上清液转入到新的1.5 mL离心管中。
（3）上清液在1530 ℃下温浴5 min后，以每1 mL Trizol试剂加入0.2 mL的比例加入氯仿（1:5），剧烈摇荡，1530 ℃下温浴23 min。

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