贝莱斯芽胞杆菌5yn8防治辣椒灰霉病的生防机理研究【字数：10194】
erstand its biocontrol mechanism, the activity of hydrolase, the inhibitory effect of secondary metabolites and volatile compounds (VOCs), and the induction of plant defense responses and defense-related gene expression were studied in this paper. The results showed that 5YN8 can produce hydrolytic enzymes like proteases as well as cellulase and siderophore, inhibiting the growth and reproduction of pathogenic bacteria. And the VOCs produced by 5YN8 could inhibit the growth of B. cinerea by inhibiting the growth of the mycelium and the germination of the spores. Faster cellular defense responses were induced, leading to the burst of reactive oxygen species, and the activity of the plant defense-related enzymes including superoxide dismutase(SOD), peroxidase(POD) and catalase (CAT) were significantly enhanced. At the same time, the expression levels of defense-related genes PR1 and NPR1 associated with salicylic acid (SA) signaling pathway can also be significantly increased, indicating that 5YN8 can control pepper gray mold through salicylic acid signaling pathways. 引言 辣椒是一种常见的蔬菜，营养丰富，可以直接食用，也能作为调味品。同时，辣椒也是一种重要的经济作物，在我国各地均有种植，其产业规模居于蔬菜首位[1]。由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.）引起的辣椒灰霉病是辣椒生产及采后防腐保鲜工作中的重要病害。该病害在我国普遍发生，对于辣椒的产量和品质均有严重影响，每年都造成巨大的损失。最近几年以来，我国辣椒种植的面积不断增大，辣椒灰霉病的发生也逐年加重，常导致叶片、果实大量腐烂，造成重大损失。灰葡萄孢菌具有较为广泛的寄主，除辣椒外，还可侵染西红柿、黄瓜、大蒜、莴苣、柑桔、葡萄、草莓等约235种蔬菜、水果和农作物[2]。 目前，我国主要通过化学农药来防治辣椒灰霉病，但化学农药的使用易造成环境污染、生态安全等问题，且易引起病原菌的抗药性，对非靶标生物也会造成影响[3-4]。此外，农药的残留问题也令人担忧。因此，急需寻求一种绿色、环保、安全、无污染的防治方法来减少化学农药的使用。与此同时，对人畜安全、对环境无污染、无残留的生物防治方法正逐渐受到各国研究者的关注与重视。国内外许多研究表明，不少细菌、真菌都对蔬菜灰霉病有着不错的防治效果。Paul等[5]研究发现一种腐霉菌，能够通过重寄生作用抑制灰霉病菌，防止葡萄灰霉病的发生。Martínezhidalgo等[6]报道从苜蓿根瘤上分离出的小单孢菌(Micromonospora)能有效防治番茄灰霉病。乔俊卿等[7]研究发现枯草芽胞杆菌PTS-394能够诱导番茄植株产生系统抗病性，从而提高其抗病能力，防治番茄灰霉病。拮抗作用是指生防菌可通过产生多种拮抗物质，抑制病原菌的生长和代谢，这些拮抗物质主要包括水解酶类、抗生素等次生代谢产物以及其他抗菌物质，如蛋白酶、几丁质酶、嗜铁素等，是生防菌的一个重要的作用机制。几丁质、纤维素、葡聚糖等是真菌细胞壁的主要成分，生防菌可通过分泌水解酶，抑制病原菌细胞壁的形成，从而抑制其生长。嗜铁素能够与环境中的三价铁离子发生螯合作用，与铁离子结合，如此，病原菌因为缺乏铁元素而不能正常生长，受到抑制。在微生物生长代谢过程中，能够产生一些挥发性有机物(VOCs)，如醇类、酸类、醛类、酯类、硫化物等，这些物质能够在一定程度上抑制植物病原菌的生长，是微生物发挥生防作用的一个重要因素[8-9]。同时，生防菌还可以通过诱导植株产生系统抗病性，引起植株体内的防卫反应，如过敏性细胞坏死反应、活性氧的爆发、植物保卫素（PA）的产生、植物防御相关酶活性的变化以及病程相关蛋白（PRP）的积累等，来抵御病原微生物的侵染[10]。活性氧的爆发是植物抗病性的表现之一，当植物受到病原微生物的侵染后，植物细胞内的活性氧爆发，引起细胞发生过敏性坏死反应。植物体内的防御酶主要有多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等[11]。过氧化氢酶在植物中主要起到降解过氧化氢的作用，在保持植株体内活性氧的平衡等方面有着重要作用；过氧化物酶除了催化降解过氧化氢外，还能催化合成木质素，使植物细胞壁木质化，帮助植物抵抗病原菌；超氧化物歧化酶能够清除植株体内氧自由基，起到抗氧化的作用，是一种重要的活性物质。植物的防卫反应被诱导表达之后，可以通过植株系统信号传导，诱导其他部位产生抗病性，包括系统获得抗性（SAR）和诱导系统抗性（ISR）[12]。两者都是诱导抗性的一种形式，提供全株性、广谱的抗性，但两者的所依赖的信号转导通路不同。ISR的信号转导主要通过茉莉酸（JA）和乙烯（ET）信号通路，而SAR则需要激活水杨酸（SA）信号通路，诱导相关防卫基因表达，积累病程相关蛋白。NPR1基因是SAR 和ISR 信号通路中共同所需的调控因子[13]。Pin II基因与JA信号通路有关[6]；Tin1则是与ET信号通路相关的防卫基因[14]。Perxidase是编码过氧化物酶的基因。 在本次试验中，实验室前期已经筛选得到辣椒灰霉病的拮抗菌株——贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis 5YN8，但其具体生防机制尚未清晰。为了进一步明确生防菌株B. velezensis 5YN8的抗病机理，本文研究了5YN8水解酶的活性，次生代谢产物和挥发性物质(VOCs)的抑菌作用，以及其诱导的植物细胞防卫反应与防卫相关基因的表达情况，以期进一步探究生防菌B. velezensis 5YN8防治辣椒灰霉病的作用机制。1 材料与方法1．1 供试材料1．1．1 辣椒品种本研究选取“苏椒5号”辣椒品种进行相关试验。该品种辣椒是由江苏省农科院蔬菜所选育，具备较好的耐肥，耐弱光，耐低温能力，对灰霉病菌B. cinerea BC1301感病。辣椒种子种在塑料托盘中，光周期设置为16/8 h，25-28℃条件下培养，待辣椒幼苗长至4-6叶期即可进行移栽，用于开展后续试验。1．1．2 供试菌株贝莱斯芽胞杆菌B. velezensis 5YN8及灰霉病菌B. cinerea BC1301均由大学生物农药及绿色植保实验室提供。灰葡萄孢菌B. cinerea BC1301用于开展平板拮抗试验、温室试验等。将灰葡萄孢菌接种在PSA平板中，25℃下避光培养，一部分用于制作菌饼，另一部分用于制作孢子悬浮液。孢子悬浮液制作方法如下将灰葡萄孢菌培养在PSA平板中，待其产孢后，用配制的40 mL溶液（0.1 mol/L蔗糖、0.01 mol/L磷酸二氢钾、0.025%吐温-20）洗脱孢子，并用双层纱布过滤去除菌丝碎片，收集的滤液即为其孢子悬浮液。用配制的溶液将孢子悬浮液调制成5×106个孢子/mL，备用。生防菌菌液制备将生防菌5YN8接种在LB平板上，28℃培养24 h后，挑取单菌落在LB培养液中进行扩增，28℃、200 rpm振荡培养24 h，将浓度调至5×107 CFU/mL，制成菌液备用。1．1．3 主要培养基生防细菌培养用LB培养基，扩增用LB培养液；病原真菌培养用PSA培养基；体外拮抗试验在分隔平板上进行，培养基用PSA培养基和TSA培养基。LB (Luria-Bertani)液体培养基取10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化钠，加水溶解后定容至1000 mL，调pH值至7.0，121℃高温高压灭菌20 min，冷却后备用。LB（Luria Bertani）固体培养基LB液体培养基制备后，加入1.5%的琼脂后121℃ 高温高压灭菌20 min后冷却备用。PSA培养基称取200 g去皮马铃薯，切成小块，放入锅中煮沸约半小时，待其稍微冷却后用纱布过滤，在滤液中加入20 g蔗糖溶解，在三角瓶中加入15 g琼脂，将滤液转移到三角瓶中，加水至1000 mL，121℃高温高压灭菌20 min，冷却后备用。TSA培养基取15 g胰蛋白胨，5 g大豆蛋白胨，5 g氯化钠，加水溶解后定容至1000 mL，加入1.5%的琼脂后调pH值至7.3，121℃高温高压灭菌20 min，冷却后备用。1．1．4 主要仪器超净工作台、酒精灯、高压灭菌锅、微波炉、恒温培养箱、恒温摇床、烘箱、高速冷冻离心机、PCR仪、酶标仪等。1．2 试验方法1．2．1 生防菌水解酶活性的检测（1）蛋白酶活性测定采用平板透明圈法，将生防菌5YN8接种在蛋白酶鉴别培养基上，25℃培养3 d后观察是否有透明圈形成。（2）几丁质酶活性测定将生防菌5YN8接种在几丁质酶鉴别培养基上，25℃培养3 d后观察有无透明圈。（3）纤维素酶活性测定将生防菌5YN8接种在羧甲基纤维素钠平板上，25℃培养3 d后，用1 g/L的刚果红染液对培养基进行染色，1 h后倒掉染液，再向平板中加入1 mol/L氯化钠溶液，浸泡漂洗1 h，观察有无透明圈形成。（4）β-1,3-葡聚糖酶活性测定将生防菌5YN8接种在刚果红葡聚糖检测平板上，25℃条件下培养3 d后，观察平板上有无透明圈。（5）嗜铁素活性测定利用铬天青（CAS）培养基对嗜铁素活性进行测定。将生防菌5YN8接种在CAS培养基上，30℃下培养3 d后，观察菌落周围是否有黄色嗜铁素螯合圈的产生；若产生黄色螯合圈，则表明5YN8具有嗜铁素活性。相关培养基参照李海峰[15]的方法进行配制。1．2．2 生防菌次生代谢产物的提取与抑菌活性的检测生防菌次生代谢产物的提取（1）挑取生防菌5YN8单菌落接种在5 mL的LB培养液中，28℃、200 rpm振荡培养12 h，作为种子液。（2）将种子液接种在500 mL的LB培养液中，进行扩增培养，28℃、200 rpm条件下振荡培养48 h。（3）取发酵液10000 g离心，离心后取上清液用0.22 μm孔径的滤膜进行过滤，冷冻抽干24 h，即得到次生代谢产物，备用。生防菌抑菌活性的检测按照Dhia Hassawi等[16]的方法进行平板拮抗试验。取生长状况良好的灰霉菌平板，制成直径6 mm的菌饼。另取空白平板，用打孔器在上面对称位置打取4个孔。将菌饼倒置于空白平板中心，在孔内分别加入已制备好的次生代谢产物和对照液体LB培养液。25℃避光培养，待灰葡萄孢菌的菌丝生长至培养基边缘时，观察培养基中菌丝体的生长情况。1．2．3 生防菌挥发性物质的抑菌活性检测在分隔平板中进行挥发性物质（VOCs）的抑菌试验，方法如下往分隔平板的一边加入TSA培养基，另一边加入PSA培养基。凝固后，挑取5YN8单菌落接种于TSA培养基上，并设置空白处理作为对照。28℃培养4 d后，将灰葡萄孢菌菌饼接种于PSA培养基上。培养皿用封口膜密封，隔绝空气，防止污染。将平板于25℃倒置培养5 d，观察平板中的菌丝生长情况，并用显微镜观察孢子萌发情况。1．2．4 辣椒叶片活性氧爆发的测定辣椒幼苗培养至4-6叶期后，移栽并进行实验。辣椒幼苗进行灌根处理，使用注射器将生防菌菌液缓慢接种在辣椒幼苗根部，每株幼苗20 mL。5 d后在辣椒叶面喷雾接种灰葡萄孢菌B. cinerea BC1301孢子悬浮液。共设4个处理（1）生防菌预处理后接种灰葡萄孢菌（5YN8+Botrytis）；（2）生防菌预处理，但不接种灰葡萄孢菌（5YN8）；（3）只接种灰葡萄孢菌，不接种生防菌（Botrytis）；（4）空白对照（每棵苗无菌水灌根20 mL）（CK）。待接种灰葡萄孢菌12 h后，各个处理分别采集3片辣椒叶片进行后续实验。利用DAB染色方法[17]对辣椒叶片进行染色。DAB染液用以下方法配制称取50 mg DAB·4HCl放入烧杯，并加入45 mL无菌水，用磁力搅拌器进行搅拌。由于DAB是光敏的，因此用锡箔纸将烧杯包住。向搅拌的DAB溶液中加入25 μL吐温20（0.05%V/V）和2.5 mL 200 mmol/L Na2HPO4溶液，即得到50 mL 1mg/mL的DAB溶液。将叶片放入培养皿中，向其中加入DAB染液至浸没叶片为止，用锡箔纸包裹培养皿，将培养皿放入干燥器中真空处理5分钟左右。真空结束后将培养皿取出，放在摇床上以80-100 rpm的速度孵育8 h。孵育结束后，取出平板除去锡箔纸，并用漂白溶液（乙醇乙酸甘油=311）替换DAB溶液，放在沸水浴（95℃）中15 min，除去叶绿素。漂白结束后用新鲜的漂白溶液替换，染色完成。观察叶片的染色情况。1．2．5 植物防卫相关酶活性的检测分别采集灰霉病菌处理前（0 h）、处理后6、12、24、48、72、96 h的辣椒叶片，用于测定相关酶活。各处理设置同活性氧爆发检测试验。总超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT) 的活性测定根据从南京建成生物工程研究所购买的相应试剂盒进行。（1）SOD活性测定本实验通过羟胺法测定叶片SOD的活性。参照说明书依次加入各项试剂，混匀后在37℃下孵育20 min，用酶标仪测定其在405 nm处的OD值。以下为SOD活力计算公式。SOD活力（U/g组织）=SOD抑制率（%）÷ 50% ×反应体系稀释倍数× 测试前稀释倍数÷组织称重（g）所加匀浆缓冲液（mL）（2）POD活性测定按照说明书依次加入各项试剂，混匀后，3500 rpm离心10 min。测定上清液在420 nm处的OD值，光径1 cm。POD活力计算公式如下。POD活力（U/mgprot）=（测定OD值–对照OD值）× 反应液总体积÷反应时间（30分钟）12 × 比色光径 × 取样量（mL）÷匀浆蛋白浓度（mgprot/mL）×1000（3）CAT活性测定本次试验采取可见光法测定CAT活性。依照说明依次添加各项试剂，混匀后测定其在405 nm处的OD值，以每毫克组织蛋白每秒钟分解1 μmol的H2O2的量为一个活力单位。CAT活力计算公式如下。CAT活力（U/mgprot）=（对照OD值–测定OD值）×271 ÷待测样本蛋白浓度（mgprot/mL）60×取样量1．2．6 辣椒叶片RNA的提取选取4-6叶期的辣椒幼苗进行实验，各处理设置与上述试验相同。在接种灰霉病菌后各时间段（处理前（0）、6、12、24、48、72、96 h），分别采集各处理辣椒叶片，进行RNA的提取。本次试验采用天根生化科技有限公司的RNA simple Total RNA Kit试剂盒进行样品RNA的提取。各试验步骤参照说明书进行。1．2．7 反转录使用Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒进行逆转录。（1）去除基因组DNA。根据表1配制反应混合物，配制好后将样品按照反应条件（42℃，2 min；4℃）进行处理。表1.去除基因组DNA试剂使用量5×gDNA Eraser Buffer2.0 μLgDNA Eraser1.0 μLTotal RNA*1RNase Freed H2Oup to 10 μL（2）反转录。根据表2配制混合物，混匀后进行反转录反应。反转录按照以下条件进行37℃，15 min；85℃，5 sec；4℃。表2.SYBR® Green qPCR法试剂使用量步骤1的反应液10.0 μLPrime Script RT Enzyme Mix I1.0 μLRT Primer Mix *41.0 μL5×Prime Script Buffer 2（for Real Time）4.0 μLRNase Free dH2O4.0 μLTotal20 μL1．2．8 Q-PCR使用Power SYBR Green PCR Master Mix预混合Ex-Taq混合物在7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosys-tems)系统上进行Q-PCR。反应条件如下95℃预变性3 min，接着95℃变性15 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，共40个循环，最后72℃延伸5 min结束。引物序列见表3。表3.植物Q-PCR分析所用引物序列基因Gene引物Primer（5’-3’）作用FunctionCaNPR1-F-ACTTCTTCGCCGACGCCAAG-SA和JA/ET信号通路CaNPR1-R-GCCAACACATTCACCAGAGCATC-CaPR1-F-ACTTGCAATTATGATCCACC-SA信号通路CaPR1-R-ACTCCAGTTACTGCACCATT-CaTin1-F-AGCCTGAAATAGAAGAAACGGAGATGGAGATGAGA-ET信号通路CaTin1-R-ACTTGCAATTATGATCCACC-CaPIN II-F-GCAACTATTACAGCGTCATCGG-SA信号通路CaPIN II-R-GGGTCAGACTCTCCTTCACAAA-CaPeroxidase-F-GGCGCCAGGATTGCTGACAA-合成过氧化物酶CaPeroxidase-R- GTGGACATAATCCTCGAAGC-CaActin-F-CACTGAAGCACCCTTGAACCC-内参基因CaActin-R-GAGACAACACCGCCTGAATAGC-1．2．9 数据分析本研究中所有试验均重复3次。使用DPS 7.05软件及Excel 2013软件对数据进行方差分析。通过最小显著性差异法（LSD）对数据进行检验（P=0.05）。2 结果与分析2．1 生防菌水解酶活性的检测结果见图1。通过检测5YN8水解酶和嗜铁素的活性，可以看出，5YN8具有分解蛋白质、纤维素和β-1,3-葡聚糖的能力，但是不能分解几丁质，同时也具有良好的嗜铁素活性，能够结合Fe3+。图1. 5YN8水解酶活性检测注A为蛋白酶活性检测平板；B为嗜铁素活性检测平板；C为几丁质酶活性检测平板；D为β-1,3-葡聚糖酶活性检测平板；E为纤维素酶活性检测平板。2．2 生防菌次生代谢产物抑菌活性的检测提取生防菌5YN8的次生代谢产物，进行平板抑菌试验。结果如图2所示，5YN8的次生代谢产物对灰葡萄孢菌的生长有一定的抑制作用，但抑菌效果不是很明显。说明生防菌防治灰霉病除了依靠次生代谢产物外，可能还有其他作用机制。图2.5YN8次生代谢产物平板拮抗试验2．3 生防菌挥发性物质的抑菌活性检测25℃下培养5 d后，取出分隔平板观察灰葡萄孢菌的生长情况。试验结果如图3（A）所示，接种生防菌5YN8的分隔平板上的灰葡萄孢菌菌丝生长范围远远小于对照组，表明灰葡萄孢菌的生长受到生防菌5YN8抑制。挑取菌丝在显微镜下观察，发现5YN8平板上的灰葡萄孢菌的孢子萌发率远远小于对照组，且分生孢子梗缢缩(图3（B）)，说明生防菌B. velezensis 5YN8的挥发性物质能够抑制灰葡萄孢菌菌丝的生长与孢子的萌发。图3.挥发性物质（VOCs）对灰霉菌的抑制作用2．4 辣椒叶片活性氧爆发的检测接种灰葡萄孢菌12h后辣椒叶片中的活性氧的爆发情况如图4所示。与对照组相比，5YN8预处理后接种病原菌，在试验的辣椒叶片上可以观察到有大量褐色斑块，表明该处理辣椒叶片中活性氧的爆发；只接种灰葡萄孢菌而不接种生防菌，只能够观察到少量褐色斑点；只接种生防菌而不接种灰葡萄孢菌，则未观察到褐色斑点。以上结果说明生防菌5YN8预处理后接种灰葡萄孢菌，能够激活辣椒植株细胞的防卫反应，引起活性氧的爆发。图4.活性氧的爆发检测情况2．5 植物防卫相关酶活性的检测2．5．1 辣椒叶片超氧化物歧化酶（SOD）的活性变化辣椒叶片超氧化物歧化酶（SOD）的活性变化如图5所示。从总体趋势上看，灰葡萄孢菌处理后0-12h时，各处理SOD活性基本处于稳定状态；12-24 h内SOD活性迅速上升，一直到24 h时活性达到最大；24 h之后开始缓慢下降。其中，5YN8预处理后接种灰葡萄孢菌，辣椒叶片SOD活性一直高于另外三个处理，24 h时达到峰值时，显著高于对照组和只接种灰葡萄孢菌的辣椒叶片SOD活性；而只接种生防菌5YN8，不接种灰葡萄孢菌，叶片的SOD活性相比略低，但高于另外两个处理。表明生防菌5YN8可以提升辣椒叶片内SOD的活性。2．5．2 辣椒叶片的过氧化氢酶（CAT）活性变化 辣椒叶片中过氧化氢酶（CAT）的活性变化如图6所示。生防菌预处理后接种灰葡萄孢菌，叶片中的CAT活性在接种灰葡萄菌后的72 h内一直呈上升趋势，在72 h达到顶峰，72-96 h内急剧下降。而另外3个处理的CAT活性则在略有上升后下降，但变化不大，但一直低于生防菌预处理后的辣椒叶片CAT活性。由此可以看出，生防菌5YN8预处理后接种灰葡萄孢菌可诱导辣椒体内CAT活性增强。图5.辣椒叶片超氧化物歧化酶（SOD）的活性变化图6.辣椒叶片的过氧化氢酶（CAT）活性变化图7.辣椒叶片的过氧化物酶（POD）活性变化2．5．3 辣椒叶片的过氧化物酶（POD）活性变化辣椒叶片过氧化物酶（POD）的活性变化如图7所示。辣椒叶片POD的活性变化与CAT较为相似。生防菌预处理后接种灰葡萄孢菌，辣椒叶片的POD活性显著高于另外3个处理，在0-72 h内总体呈上升趋势，在72 h时达到顶峰，72-96 h内急剧下降；另3个处理的POD活性略有上升，但远小于5YN8+Botrytis处理。说明生防菌5YN8预处理后可以引起辣椒植株体内POD活性的升高。2．6 植物抗病相关基因表达分析在本次研究中，我们分别检测了各处理辣椒叶片接种灰葡萄孢菌后0，6，12，24，48，72和96 h基因NPR1，PR1，Pin II，Tin1和Perxidase的表达情况。图8为NPR1基因的表达情况。从整体趋势上看，NPR1基因的表达0-48 h内持续上升，48 h后下降。5YN8预处理后接种灰葡萄孢，在24-48 h时其NPR1基因的表达显著提高。该处理NPR1基因的表达量约为对照组的1.4倍和Botrytis处理的1.3倍。说明5YN8预处理后接种灰葡萄孢菌可以诱导NPR1基因的表达。PR1基因的表达情况见图9。从图中可以明显看出，生防菌预处理后接种灰葡萄孢菌48 h，其PR1基因的表达被强烈的诱导，约为对照组的5.3倍，且约为Botrytis处理的4倍，总体趋势与NPR1基因一致。说明5YN8预处理后接种灰葡萄孢菌可以诱导PR1基因的表达。本研究还检测了辣椒叶片内Pin II基因与Tin1基因在接种灰葡萄孢菌后的表达情况，结果见图10和图11。两者结果较为相似，各不同的处理之间，其基因的表达情况并没有显著的区别。说明5YN8诱导植物抗病性与基因Pin II和基因Tin1无关。这些结果表明生防菌Bacillus velezensis 5YN8是通过水杨酸（SA）信号通路来防治辣椒灰霉病的，与茉莉酸和乙烯（JA/ET）信号通路无关。Perxidase是编码过氧化物酶的基因，结果如图12所示。生防菌预处理后接种灰葡萄孢菌，72h后其Perxidase的表达量达到峰值，且显著地高于对照组和只接种灰葡萄孢菌的处理，其结果符合上述POD活性变化的检测结果。图8.NPR1基因的表达情况图9.PR1基因的表达情况图10.Pin II基因的表达情况图11.Tin1基因的表达情况图12. Perxidase基因的表达情况3 讨论灰葡萄孢菌能够侵染多种植物并形成灰霉病，如番茄、草莓等，是一种全球性的病害，每年都造成十分巨大的损失。在适宜条件下，病原菌可以侵染植物的各个营养部位，如叶，球茎，茎，甚至是观赏植物的花朵[18]。因此，在农作物生产过程中寻找有效的防治灰霉病的防控策略势在必行。利用拮抗微生物或其代谢产物来抑制植物病原菌侵害作物的生物防治方法具有安全、高效、环境友好等优点，是目前研究的热点。在我们前期的研究中，已经筛选出对辣椒灰霉病具有防治效果的生防菌株5YN8，经鉴定其为贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）。贝莱斯芽胞杆菌是一种新型的生防细菌，国内外有不少研究人员对该菌进行过报道。Nam等[19]从土壤中分离得到B. velezensis BS87和RK1菌株，经田间试验，发现两者均可用于防治草莓枯萎病。王伟等[20]筛选获得的X-75菌株，经检测发现其对番茄灰霉病菌具有拮抗作用。此外，还有研究者已研发出贝莱斯芽胞杆菌生物制剂，用于真菌病害的防治[21]。虽然已有许多研究证明贝莱斯芽胞杆菌对病原菌具有抑制作用，但是关于其具体的防病机理和作用机制还不清楚。微生物产生的次生代谢产物，如水解酶类、嗜铁素等，能够抑制病原菌的生长。本研究对生防菌5YN8的次生代谢产物进行了平板拮抗试验，发现它对灰葡萄孢的生长有一定的抑制作用，但抑制作用不明显。我们进一步检测了5YN8产生的蛋白酶、几丁质酶、β-1,3葡聚糖酶、纤维素酶和嗜铁素的活性。结果表明，5YN8具有以上几种酶中除了几丁质酶以外其他酶的活性，表明该菌具有较好的生防潜力。细菌可以产生挥发性物质来抑制或促进其他生物的生长和代谢，目前，许多研究发现挥发性物质具有预防农作物病害、促进生长、增加产量的作用。王雪洁等[22]从葡萄植株中分离得到内生菌株HB135，经过试验研究，发现该菌能够产生挥发性抑菌物质，抑制葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)的生长。穆静娟等[23]筛选得到枯草芽胞杆菌M29，该菌能够产生挥发性物质来抑制烟曲霉孢子的生长繁殖。此外，该菌还能抑制多种病原菌色素的产生。本研究通过分隔平板试验发现，生防菌B. velezensis 5YN8的挥发性物质可以抑制B. cinerea BC1301孢子的形成和菌丝的生长。然而，本次研究没有对B. velezensis 5YN8的次生代谢产物和其产生的VOCs进行研究，还需进一步研究对其物质组分进行分析。SOD和POD是植物体内的防卫相关酶，在抗氧化方面有着十分重要的作用，与植株抗病性相关。本研究发现，5YN8预处理后辣椒叶片的POD活性显著提高；经过5YN8预处理，再接种病原菌，叶片SOD活性迅速上升，24 h时达到最大值，POD活性在72 h时达到最大值，均显著高于未接种生防菌5YN8的Botrytis处理，说明生防菌5YN8能够诱导植物体内防御相关酶的活性升高，抵御病原菌的侵染。CAT在植物中起着非常重要的作用，它是降解H2O2的关键酶。研究结果表明，5YN8预处理后接种病原菌，辣椒叶片CAT活性迅速上升，在72 h时到达最大值，与POD活性变化相同。同时，通过检测基因Perxidase的表达，验证了POD活性的变化。表明生防菌5YN8预处理辣椒后，能够诱导植株产生诱导抗病性。植物抗病防卫信号传导主要有两条通路，有水杨酸（SA）信号通路，茉莉酸和乙烯（JA/ET）信号通路。在本研究中，我们通过Q-PCR试验检测与它们相关的基因NPR1、PR1、Pin II、Tin1的表达情况。结果显示，预处理B. velezensis 5YN8后接种灰葡萄孢菌能强烈地诱导SA信号传导途径相关的NPR1和PR1基因的表达，而JA/ET信号途径相关的基因没有明显变化，说明B. velezensis 5YN8可以通过激活SA信号通路，激发辣椒植株的防卫反应，增强系统抗病性。综上结果表明，贝莱斯芽胞杆菌5YN8可以产生蛋白酶、纤维素酶等水解酶及嗜铁素，抑制生防菌的生长繁殖，还可以通过释放挥发性有机化合物（VOCs）来抑制灰葡萄孢菌B. cinerea菌丝的生长和孢子形成，并可以诱导植物产生防卫反应，如活性氧的爆发，相关防御酶活性的变化等。另外，5YN8还可通过水杨酸（SA）信号通路，诱导植物中防御相关基因的表达，从而抵抗病原菌的侵染。然而，有关于生防菌B. velezensis 5YN8如何触发植物防卫反应来抵抗病原菌，还有待进一步深入研究。致谢感谢廖梦婕师姐在毕业实习期间给予我的极大帮助，并在论文的撰写过程中为我提出宝贵意见。感谢米丹丹、朱凯、张丽娜、窦国霞、范志航等师兄师姐在在毕业实习期间对我的帮助。感谢徐孙德师兄在我浙大实习期间对我的照顾。感谢大学植物保护学院尤其是植保143班的同学们，感谢你们在这四年的学习生活中给我的鼓励和支持，这四年将成为我最难忘的岁月。需要感谢的人还有很多，这里无法一一列举，祝愿大家永远健康，快乐，幸福。参考文献[1] 王立浩, 张正海, 曹亚从,等. “十二五”我国辣椒遗传育种研究进展及其展望[J]. 中国蔬菜, 2016, 1(1):1-7.[2] 纪军建, 张小风, 王文桥,等. 番茄灰霉病防治研究进展[J]. 中国农学通报, 2012, 28(31):109-113.[3] Shoda M. 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目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 供试材料2
1.1.1 辣椒品种2
1.1.2 供试菌株3
1.1.3 主要培养基3
1.1.4 主要仪器3
1.2 试验方法3
1.2.1 生防菌水解酶活性的检测3
1.2.2 生防菌次生代谢产物的提取与抑菌活性的检测4
1.2.3 生防菌挥发性物质的抑菌活性检测4
1.2.4 辣椒叶片活性氧爆发的测定4
1.2.5 植物防卫相关酶活性的检测4
1.2.6 辣椒叶片RNA的提取5
1.2.7 反转录5
1.2.8 QPCR6
1.2.9 数据分析6
2 结果与分析6
2.1 生防菌水解酶活性的检测6
2.2 生防菌次生代谢产物抑菌活性的检测7
2.3 生防菌挥发性物质的抑菌活性检测7
2.4 辣椒叶片活性氧爆发的测定8
2.5 植物防卫相关酶活性的检测8
2.5.1 辣椒叶片超氧化物歧化酶（SOD）的活性变化8
2.5.2 辣椒叶片的过氧化氢酶（CAT）活性变化8
2.5.3 辣椒叶片的过氧化物酶（POD）活性变化10
2.6 植物抗病相关基因表达分析10
3 讨论 12
致谢13
参考文献13 贝莱斯芽胞杆菌 5YN8防治辣椒灰霉病的生防机理研究
引言
原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/zwbh/561624.html
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