花青苷的合成过程中，多种转录因子参与调控，其中MYB基因家族的成员众多，而各转录因子对花青苷的调控效果不一。在紫胡萝卜‘Deep purple’中发现了能够促使花青苷合成的DcMYB7基因，但这个基因在番茄中的生物功能尚不明确，本研究利用PCR技术，从紫胡萝卜‘Deep purple’中克隆出DcMYB7的编码区，全长为903 bp，构建根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 表达载体，将其转入番茄外植体，获得转基因植株。通过结合抗生素筛选和PCR检测目的基因，得到了转基因植株。观察发现DcMYB7在番茄中过量表达，明显提高转基因植株的花青苷含量。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 实验材料 2
1．1．1 植物材料 2
1．1．2 菌株、载体及主要试剂 2
1．1．3 仪器设备 3
1．2 方法 3
1．2．1 DcMYB7的生物信息学分析 3
1．2．2 目的基因的克隆 3
1．2．3 构建表达载体，转化到农杆菌 4
1．2．4番茄的遗传转化 5
1．2．5 DcMYB7转基因植物的分子鉴定 5
2 结果与分析 6
2．1 DcMYB7的生物信息学分析 6
2．2 DcMYB7基因的克隆 7
2．3 番茄转基因植株的获得 8
2．4 DcMYB7转基因番茄的鉴定 8
3 讨论 9
致谢 9
参考文献 10
过量表达DcMYB7促进番茄花青苷的合成
引言
引言：番茄（Solanum lycopersicum L.）因其独特的风味深受人们喜爱，既可以成为餐桌上的佳肴，又能作为可口的水果食用，内含多种维生素等营养物质。除此之外，番茄还是一种在当代生物科学研究中具有重要意义的模式植物，在多方面与人类生活息息相关[1]。由于番茄的受欢迎程度，在国内乃至全世 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
界广泛种植。2012年番茄基因组测序的完成，为研究其功能基因提供了更有利的途径。
花青苷是一种黄酮类化合物，人们日常生活中更熟悉的名称是花青素，而花青素单独存在时性质不稳定，花青素和糖结合在一起，就是更稳定的花青苷了。花青苷是大多植物果实鲜亮，花瓣颜色姹紫嫣红的原因[2]。除了让植物各器官的颜色更具标志性，花青苷还具有重要的生理活性功效，比如抗氧化性的特性可被人们利用于医疗保健。人们常说“要多吃颜色深的蔬菜水果”，原因就是这些蔬菜水果中存在高含量的花青苷，另外有些国家还将花青苷作为一种抑制癌细胞，降低粥脉动脉硬化的处方药[3]。
花青苷的合成不是由苯丙氨酸一步直接合成，花青苷合成代谢途径总体有三个通路。第一阶段是合成对香豆酰辅酶A，第二阶段是催化形成二氢黄酮醇类物质，第三阶段为黄酮醇类物质被二氢黄酮醇4还原酶催化形成无色花青素。这些合成阶段受到多种遗传因子的调控[4]。调控花青苷合成的基因分为两类，一类称为结构基因，即调控花青苷直接合成的基因，另一类是调节基因，与结构基因不同的是，它们是对花青苷合成过程中各基因的表达强度的调控[5]。
植物MYB转录因子是指含有MYB基序的一类转录因子，MYB基因家族在植物生长过程中具有重要作用，以MYB 保守域的重复基序的数量为依据，可以将MYB家族分为 4种类型，即1RMYB，R2R3MYB，3RMYB，4RMYB 。R2R3MYB是MYB家族中最大的亚家族，它们主要参与植物激素信号转导、一级和次生代谢、决定细胞分化、调控植物生长发育以及响应生物和非生物胁迫[6]，1RMYB参与植物次生代谢调控、形态建成、生物钟调节、生理胁迫响应以及花和果实的发育[7]。MYB转录因子与花青苷的合成关系为，花青苷合成是由多种结构基因调控，而这些基因相互之间存在协同作用，MYB转录因子形成的转录复合体会影响到这种协同调控，而使花青苷的最终含量呈现差异[8]。
植物次级代谢的重要一大类型是苯丙氨酸代谢途径，MYB基因参与了这个代谢途径。在金鱼草，苹果，葡萄等都可以找到相应的例子。比如金鱼草中AmMYB305和AmMYB340能够激活关键酶的表达，从而促进苯丙烷类代谢途径，促进花青素合成[9]。Takos等在2006年从苹果中成功分离出MdMYB1，此基因能够对果皮花青苷的合成有影响，同时，发现在转录过程中，该基因会受到光照强烈诱导，与花青苷的合成呈正相关[10]。
近年来，关于番茄中MYB转录因子的研究也较为丰富。2003年，Mathews使用激活标记技术，借助高通量的TDNA载体，鉴定了ANT1与紫色色素形成有关，它通过提高了合成途径中相关蛋白的表达，从而促进花青素的积累，后来经过鉴定，ANT1属于MYB转录因子，此外，此蛋白还与花青素的运输和糖苷化有关系[11]。王涛等人2011年，利用cDNA末端快速扩增技术，成功获得了一个全长1350 bp的基因，此基因属于R2R3MYB类，编码338个氨基酸的MYB转录因子ShMYB1，推测花发育和番茄表皮茸毛发生过程与该基因有关[12]。刘淑君2012年测定S1MYB7，S1MYB67，S1MYB133，S1MYB199在番茄绿果和黄果中的表达量，与紫果和红果相比明显减少，与此同时，S1MYB133在紫果中的表达量最高。另外4个MYB转录因子在绿果中的表达量都是最少，结果表明在绿果中，而在紫果，红果，黄果中，表达量均呈现上调的趋势[13]。2017年，徐志胜等在胡萝卜发现了一个影响花青苷合成的基因DcMYB6，将其转入拟南芥中过量表达使其合成花青苷而呈紫色[14]。也有些MYB因子有截然不同的效果，如番茄中S1MYB12有抑制作用，此转录因子使番茄的颜色变为粉红色[15]。
MYB基因家族成员庞大，不同的MYB转录因子对花青苷的调控效果不一，大家都知道，伞形科的胡萝卜中含有较多的花青苷，而且由于紫胡萝卜中的花青苷呈现高度的乙酰化和糖基化，对光、pH和高温的条件具有较强的稳定性[16]。本项目的导师前期研究已找到控制紫胡萝卜花青苷合成的DcMYB7基因。将DcMYB7转入拟南芥和橙色胡萝卜中过量表达都能使其合成花青苷而呈紫黑色。而该基因在番茄花青苷的合成中是否具有相同生物功能尚不明确。本研究将把此基因导入番茄进行验证。

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