本试验研究了不同品种蝴蝶兰花粉块的形态差异及小孢子分离方法，初步确定适宜的酶解分离和机械分离方法，为蝴蝶兰单倍体的培养提供参考。试验对比了9个蝴蝶兰品种花粉块的形态差异并选其中不同花型的蝴蝶兰品种各一种观察花粉块中小孢子形态。分离试验以蝴蝶兰品种‘Little Gem Stripes’为材料，研究了不同酶液浓度组合下蝴蝶兰小孢子的分离情况。同时观察了蝴蝶兰小孢子在不同预处理条件下处理3d后的发育情况。试验结果表明，不同花型蝴蝶兰的花粉块大小及颜色存在较明显的差异。初步确定纤维素酶1.0 %，离析酶1.0 %处理22h以上小孢子分离效果较为理想。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1蝴蝶兰花粉块形态观察2
1.2.2蝴蝶兰花粉块石蜡切片的制作及观察3
1.2.3酶解法分离蝴蝶兰小孢子3
1.2.4预处理及机械法分离蝴蝶兰小孢子3
2结果与分析4
2.1蝴蝶兰花粉块形态观察4
2.1.1不同品种蝴蝶兰花粉块形态比较4
2.1.2蝴蝶兰花粉块石蜡切片的制作及观察4
2.2蝴蝶兰花粉块石蜡切片观察4
2.3蝴蝶兰小孢子的分离4
2.3.1酶解法分离蝴蝶兰小孢子4
2.3.2预处理机械法分离蝴蝶兰小孢子7
3讨论 7
致谢9
参考文献9
图1 试验所用蝴蝶兰及其花粉块5
图2 蝴蝶兰不同发育时期花粉块的形态特征6
图3 不同花型蝴蝶兰花粉块的组织学特征6
图4 酶解法及机械法分离所得的小孢子7
图5 机械法分离小孢子效果7
图6 荧光显微镜下小孢子中细胞核及叶绿体分布情况8
表1 不同酶液浓度对蝴蝶兰小孢子游离的影响6
蝴蝶兰小孢子分离条件的优化研究
引言
蝴蝶兰因其花色艳丽，形态多样，姿态优美且花期较长而越来越受到 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
大众追捧，是兰科植物中栽培最广泛，最受欢迎的种类之一[1]，在国、内外花卉市场上的地位日益提高[2]。由于蝴蝶兰种子不含胚乳，常规条件下很难萌发[3]，故多采用组织培养的方式进行繁殖，蝴蝶兰常用外植体为茎尖、休眠芽、隐芽、花梗[4]。蝴蝶兰花粉块中小孢子数量庞大，但常规方法不易分离，若能成功分离、纯化和培养形成胚状体或类原球茎，并诱导分化为单倍体植株，不仅可以缩短蝴蝶兰自交系培育时间缩短育种周期，还能为蝴蝶兰基因转移等奠定良好技术基础，同时便于物理或化学诱变。在经过诱变处理后进行染色体加倍，突变性状可直接在当代植株形状上表现出来，利于提高突变体筛选率[5]。而成熟的蝴蝶兰小孢子分离技术是进一步探索其培养条件的基础。
传统育种方法周期长，不利于新品种的培育，而单倍体育种是在离体条件下快速获得单倍体植株，加倍后可获得纯合的二倍体植株，为新品种的培育提供纯合自交系，可极大地缩短育种年限，提高育种效率。小孢子培养是单倍体育种的重要方法之一，相较于其他培养方法，游离的小孢子是天然的单倍体，无其他体细胞的干扰，可以快速获得大量单倍体植株。与此同时，小孢子培养技术可与基因工程技术相结合增加新品种开发的可能性。Tulecke首次培养银杏花粉成功获得愈伤组织，但最终未能再生成完整植株[6]。Lichter首次通过培养甘蓝型油菜( Brassica napus) 花粉，成功获得单倍体植株，自此游离小孢子培养技术开始成为研究的热点问题[7]。当前，园艺植物小孢子培养主要在蔬菜作物育种上被广泛应用，而在观赏植物和果树中成功报道相对较少。这种情况可能与蔬菜作物与人们的日常生活关系更加密切，致使人们对其育种的进展更加重视有一定关系，也与木本植物小孢子的培养难度较大有关。随着小孢子培养技术的提高，果树和花卉的小孢子培养技术也将会有更广泛地应用。目前，在蔬菜、作物、果树上有关小孢子培养技术的相关报道较多，如茄子、芥蓝、黄瓜等园艺植物及大麦、小麦、陆稻等农作物上取得很大进展；而在花卉、药用植物方面报道相对较少[5]。蝴蝶兰小孢子分离及培养国内外尚未见报道，但同为单细胞蝴蝶兰原生质体分离及纯化已有少量报道[8]，故可为小孢子的分离纯化方法提供参考。
大部分兰科植物花粉为复合花粉，伍成厚制作了花粉块的石蜡切片用以观察蝴蝶兰雄配子体的发育过程，经观察发现小孢子母细胞经减数分裂形成四分体，减数分裂的四个小孢子排列以四面体形为主，但还具备其他形态，小孢子四分体联合形成花粉小块，花粉小块再聚集发育成花粉块[9]。胡适宜等在关于春兰的研究中认为兰科植物花粉粘结为花粉块可能是由于四分体间存在粘性物质、细胞较小并排列紧密等因素[10]。徐是雄指出高斑叶兰四分体之间是依靠胼胝质粘结[11]。经扫描电镜观察，蝴蝶兰花粉块花粉排列紧密但表面无明显粘接物[12]。推测蝴蝶兰花粉可能也是由于细胞间紧密的排列及胼胝质等粘合物质的存在而粘合成为花粉块。由于蝴蝶兰花粉粘结成块且坚硬不易分散，故无法采用普通的分离方法如自然释放、研磨过滤收集法等直接分离。在我们的预实验中发现，采用纤维素酶和果胶酶处理后的蝴蝶兰花粉块可以达到良好的分离效果。
本课题拟进一步观察蝴蝶兰花粉块形态特征并制作石蜡切片观察花粉块内部结构，并以蝴蝶兰品种‘Little Gem Stripes’为材料，研究花粉采集时间、不同酶液浓度组合、处理方法及处理时间长短对蝴蝶兰小孢子分离效果的影响，为蝴蝶兰小孢子培养研究提供基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
9个蝴蝶兰杂交品种均取自园艺学院观赏植物生物技术实验室温室，其中大花型品种2个，中花型品种4个，小花型品种3个。
1.1.1 蝴蝶兰花粉块形态及组织学特征观察所需用品
体式显微镜、二甲苯、无水乙醇、FAA固定液、石蜡、荧光显微镜等。

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