为了给菌核病的菌体培养、接种和抗病品种评价试验提供基础保障，本试验开展了菊花菌核病病原菌的鉴定和不同培养条件的比较试验。首先从菊花菌核病样品病株中分离纯化出多个病原菌菌株作为实验材料，通过结合病原菌ITS序列分析和科赫法则来明确致病菌，选择代表性菌株CM001进行致病性测定及培养条件的分析。分别比较了不同培养基、碳源氮源、酸碱度对病原菌培养后的菌落直径的影响，并比较了不同温度对病原菌存活率的影响。实验结果显示菊花菌核病的致病病原菌为子囊菌亚门的核盘菌（Sclerotinia sclerotioru）。菌株在pH值5~10的范围内都可以生长，pH值为10时菌丝长势最差，pH值为6时长势最好，平均菌落直径最高值相比最低增长了47.36％；病原菌对碳源要求不严格，但以蛋白胨为氮源的培养基对菌丝萌发生长最为有利，菌落直径比对照增长了10％； YEPD培养基较菌株生长最旺盛，菌落直径平均值达80mm,为对照的5.3倍；Czapek培养基则对菌丝生长产生抑制作用，相比对照组减少了56％。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1实验材料2
1.2实验方法 2
1.2.1病株的采集 2
1.2.2病菌的分离2
1.2.3菌丝的纯化培养3
1.3分子生物学鉴定2
1.4病原菌的形态学测定3
1.5病原菌的致病性测定3
1.6病原菌培养条件的分析3
1.6.1不同培养基对菌落直径的影响 3
1.6.2不同pH对菌落直径的影响 3
1.6.3不同碳氮源对菌落直径的影响 3
1.6.4不同高温对病原菌存活率的影响 3
1.7数据分析 3
2 结果与分析4
2.1病原菌形态学观察及致病性分析4
2.2基于rDNA ITS序列系统发育树的构建4
2.3 不同病原菌培养条件分析5
3 讨论7
致谢8
参考文献8菊花菌核病病原菌鉴定及培养条件分析
 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
/> 引言
菊花（Chrysanthemum morifolium），原产中国，是菊科菊属的多年生宿根草本植物[1]。菊花的观赏性很高，并且具有茶用、药用、食用等的应用，具有很高的经济价值。且菊花在中国拥有着悠久的栽培历史和浓厚的文化力量[2]，品种极多，可达三万余个[3]，随着不断地进化和自然选择，越来越多的新品种被开发，但不同的品种对各种病害的对抗能力也不尽相同。近几年，不适宜的栽培管理技术运用、过度的化肥使用及连作连茬等原因，导致菊花种植上病害问题越来越严峻和突出，病害的发生不仅危害了菊花的生长发育进程，而且严重制约了菊花产业的发展[4]。特别是在我国各大菊花产区菌核病的发病范围逐步扩大，导致部分产区的减产，甚至绝产，这对产区的经济收入产生了严重的制约。故开展菊花抗病性试验以及培育菊花抗菌核病新品种的工作迫在眉睫。
核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）又称菌核菌，属子囊菌亚门[5]，核盘菌属，是一种兼性寄生子囊真菌[6]。随着分子生物学研究手段的普及，在分子水平对真菌进行鉴定和相关的遗传分析也被越来越多地利用在病理研究中[7]。李国庆[8]等人曾应用Random Amplified Polymorphic DNA技术（简称RAPD技术）对核盘菌不同的近源属种进行了遗传多样性分析。1993年Carbone和Kohn［9］研究了核盘菌科（Sclerotiniaceae）核糖体DNA与ITS之间的异同之处，随后Holst Jensen等[10] 为确定系统遗传发育关系，对核盘菌的ITS区段的进行了相关分析，得以确定了和近缘属的相关关系。也验证了微生物核糖体基因转录间隔区（ITS）因其在进化中具有高度的保守性，故被作为真菌鉴定及其分类的重要依据之一。
但国内外对重要的农作物菌核病的研究多集中在一些油料作物上，如油菜等。相关实验结果显示，油菜的菌核病病原菌为核盘菌， pH值3.0～9.0时适合病原菌生长[11]，对菌核而言，生长温度为15～29℃最为适宜[12]。目前有接近二十种生物化学试剂[13]可以用来抵抗一些作物的菌核病，尤其在蔬菜上，isopyrazam对控制菌核病茎腐病有显著的效果。但对菊花菌核病关于菊花菌核病致病菌的鉴定和发生条件的研究未见报道。本研究中，以‘神马’菊菌核病病株上分离的菌株CM001为对象，通过分子生物学手段，结合科赫法则[14]对致病菌进行鉴定；并探究了培养基成分、pH值等环境因素对病菌菌落生长的影响，对其培养环境进行分析。希望能为菊花菌核病研究提供理论基础，也为筛选抗病新品种提供接种用病原体。
1 材料与方法
1．1 供试材料
病原菌：从大学菊花种质资源库‘神马’菊病株中分离得到。
实验仪器：培养皿、恒温振荡仪、S8APO体式显微镜、felca光学显微镜、天平、RXZ智能型人工气候箱、苏净安泰工作台、HH3A单列单控三孔水浴锅、灭菌器、摇床、PCR仪、高速离心机。
1．2 实验方法
1.2.1 病株的采集
在大学湖熟菊花基地试验大棚内进行田间观察，记录植株病害部位、病斑大小、形状和颜色，观察到部分植株的茎秆及叶片有腐烂，呈现水渍状。有白霉，偶见黑色菌核。采集具有相似症状的植株，放在4℃冰箱暂时保存。
1.2.2 病菌的分离
已采集好的发病植株，用水冲洗，取病健交界组织[15]。采用组织块法分离致病菌[16]。具体操作为：在超净工作台上，用浓度75%的酒精消毒并且浸泡组织15s，然后用15%的H2O2溶液消毒1520min，最后用蒸馏水清洗干净，过程持续8min左右，重复此过程3次；用已经灭菌了的滤纸上吸干病株上多余水分；用手术刀和镊子剪取交界处约5mm的组织，放置于准备好的PDA培养基上，封口放于28℃恒温箱中培养一周左右。
1.2.3 菌丝纯化与培养
待PDA培养基上长出病原菌后，观察菌落生长情况进行纯化培养。用打孔器或枪头在菌落边缘挑取直径约5mm菌饼23块放入提前配好的PDB培养基中，放置于28℃ 180r/min 的摇床中培养一周左右[15]；之后平板划线，分单菌落，倒板放置。一直重复该操作，直到培养出的菌落没有杂菌为止。取纯化后的菌饼置于PDA培养基上28℃培养得到较纯的病原菌。分类编号提取好的菌并按时记录生长情况。

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