菊花枯萎病是在菊花生产过程中普遍存在的一种病害，主要是由一种世界性分布的土传病原真菌尖孢镰刀菌所引起的，严重影响了菊花产业利润，给农民和生产企业带来了严重的经济损失。为了从菊花根际筛选出对尖孢镰刀菌有拮抗作用的生防菌，本研究通过平板对峙以及形态分子鉴定等手段从切花菊“神马”根际及组织中分离得到了T4-1、T4-3、G4-1、Y2-2等菌株，为将生物防治应用到菊花生产领域提供了有力的理论指导。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 供试材料 2
1.1.2 供试病原菌 2
1.1.3 培养基 2
1.1.4 仪器设备 2
1.2 方法 2
1.2.1 菌株的分离与纯化2
1.2.2 菌株的鉴定3
1.2.3 平板对峙4
2 结果与分析4
2.1 菌株分离结果4
2.2 菌株鉴定结果 4
2.3 平板对峙结果 5
3 讨论 5
4 结论 6
致谢6
参考文献7
图1 4
图2 5
菊花根际微生物的分离鉴定及生防效果研究
引言
作为世界四大切花之一，切菊花品种丰富多彩，一直深受世界各国人民的喜爱。特别是自16、17世纪中国引进原种以来，欧洲各国不断完善切花品种，形成了今天切花产业化的生产格局。近年来，切花菊已经成为了世界上商品花卉总产值中最高的花种。20世纪80年代改革开放以来，经济开始快速发展，人民生活质量得到改善，对鲜切花的需求迅速增加。因此，大量引进了日本、荷兰等花卉发达国家的切花菊花品种和切花菊花的生产技术。经过多年的研究和实践，我国切花产业发展迅速，种植面积和产量不断增加，中国已成为世界上最大的菊花生产基地。因为种植面积不断增加，菊花连作产生的病害日益严重，逐渐影响到了整个切花菊产业利润。
菊花枯萎病是一种常见的土传病害，病菌一般从根部侵入，引起维 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
管束病害。在枯萎病的早期阶段，植物的下部叶片变黄并脱落，最终，整个植物死亡，这种现象会发生在作物的整个生长期，给农民和生产企业带来严重的经济损失。而引起枯萎病的一种主要病菌就是尖孢镰刀菌(F.oxysporum)，尖孢镰刀菌是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生。目前，化学农药可以在一定程度上对枯萎病进行预防，但是在实际生产中存在诸多问题如用药量大，效果不佳等。 因此，菊花枯萎病的安全有效的防治是目前生产上急需解决的问题。
生物防治是利用一种生物或其产物对付另外一种生物的方法，具有与环境兼容性好、无残留、不伤害非靶标生物等优点，目前广泛应用于农业生产上。拮抗菌就是一种有效的生物防治措施，主要从土壤和植物病害组织中分离到拮抗细菌，从植物病害组织和健康组织中分离到部分内生拮抗细菌[1]。徐刘平等人在辣椒栖息地分离细菌的研究中首次研究了拮抗活性指数的概念，发现内生菌的拮抗指数高于外生菌，其中，叶内内生菌的拮抗指数最高，表明内生菌比植物外源微生物更具竞争性[2]。分离拮抗菌的一种常见方法就是从病菌的寄主植物组织或生境中分离，王路遥等人从小麦植株的生态环境中成功分离出了能够抑制禾谷镰刀菌（F．graminearum）的细菌[3]；王超等人从烟草植株的生态环境中筛选得到的能够高效抑制烟草青枯病的拮抗菌[4]；王宇光等人则从香蕉植株的生态环境中分离出对黄瓜枯萎病菌（F.oxyaporumf.sp.cubense）具有显著抑制作用的拮抗细菌[5]。
然而，对抗菊花枯萎病病原菌的拮抗细菌的研究还很少。因此本研究旨在通过从大学菊花基地采集样本，从而筛选出对尖孢镰刀菌有抑菌效应的生防菌并进行鉴定，以此来丰富菊花枯萎病的生物防治资源，并为其提供一定的理论指导。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 供试材料
大学湖熟菊花基地切花菊“神马”。分别取不同菊花植株的根、茎、叶以及根际土于无菌袋中保存，并做好标记。
1．1．2 供试病原菌
尖孢镰刀菌(F.oxysporum)。供试病原菌由大学园艺学院菊花课题组实验室保存。
1．1．3 培养基
PDA培养基：马铃薯 200 g/L，葡萄糖 20 g/L， 琼脂 20 g/L， 116 ℃灭菌30 min。
LB培养基：：酵母膏 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，氯化钠 10 g/L，琼脂 15 g/L。液体LB培养基不需添加琼脂，116 ℃灭菌30 min。
1．1．4 仪器设备
超净工作台，蒸汽灭菌锅，摇床，高通量组织研磨机，PCR仪，凝胶成像分析系统仪等。
1．2 方法
1．2．1 菌株的分离与纯化
准备材料。将无菌袋中的材料取出，用自来水冲洗干净（根际土不需要）；在超净工作台上，分别剪取不同菊花植株的根、茎、叶的部分组织，70% 酒精浸泡10s后，转15% 双氧水消毒15min，取出后移入无菌水中剧烈摇晃5min，重复这个过程34次；消毒完毕后，将所有的材料组织置于无菌滤纸上，吸干多余的水分，用镊子分别接种到准备好的PDA培养基上，并做好标记，将培养基放置在28摄氏度恒温培养箱中，倒置培养210天，定期观察菌落生长情况。
纯化培养。将培养基取出，对长出的菌株进行简单分类，根据是否有明显菌丝将其分为细菌和真菌两类，并判别每个培养基上是否有不同的菌种，最终确定需要进行纯培养的菌株并做好标记。细菌纯培养时采用LB培养基，因为细菌菌落的表面较光滑，所以一般使用接种环进行操作，将接种环在酒精灯上灼烧消毒后轻轻刮取菌落，然后在新的培养基上连续划“z”型线，使之均匀分布，封好培养基后在表面做好标记；真菌则依旧采用PDA培养基，接种方法采用整块接种，即用消毒过的小离心管倒扣在菌落上，将其与下面的培养基一并取出，借助工具将其固定在新的培养基中心，确保不会随意移动，然后封好培养基并做好标记。将接种完的细菌和真菌分别用胶带捆好，贴上名称和日期，继续放置在28摄氏度恒温培养箱中，倒置培养210天，定期观察菌落生长情况。

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