菊花因其颜色、花型的多样性，成为世界四大切花之一。但是，由于菊花多用扦插繁殖，易造成了菊花病毒病的传播和积累。菊花B病毒是导致菊花品质下降的主要病毒之一。本实验利用实验室已经获得的CVB病毒的衣壳蛋白的氨基酸序列，构建了菊花B病毒CP蛋白序列的进化树，分析菊花CVB病毒的遗传多样性。同时，根据已获得衣壳蛋白的碱基序列设计鉴定引物，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳技术对茶用菊CVB病毒进行快速检测。此外，为了检测CVB病毒在菊花不同组织(新叶、老叶、茎、花蕾)的分布情况，我们进行了qRT-PCR实验，结果表明，菊花新叶中CVB含量最低，老叶中CVB含量最高，茎和花蕾中也会有菊花CVB病毒的富集。这项研究为茶用菊CVB病毒的快速检测及花蕾中CVB病毒的定量检测提供了有效的方法。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1.2 方法 3
1.2.1 构建系统发育进化树3
1.2.2 序列比对分析与引物设计3
1.2.3 PCR扩增与琼脂糖凝胶泳4
1.2.4 实时荧光定量PCR4
2 结果与分析4
2.1 CVB病毒外壳蛋白基因序列进化树分析4
2.2 CVB病毒外壳蛋白基因序列分析5
2.3 PCR快速检测菊花叶片中的CVB病毒6
2.4 qRTPCR检测菊花不同组织CVB病毒分布情况7
3 讨论 8
致谢9
参考文献9
菊花B病毒衣壳蛋白遗传多样性分析与快速检测体系的建立
引言
引言
菊花凭借其花色丰富、花型多样、易于培育等出色的特性，成为了世界四大切花之一，同时也是最大众化的一种切花。菊花在秋天开放，被我国古代的诗人赋予了如高傲、孤洁等高尚品格，并为其赋诗无数，也因此，菊花成为我国十大名花之一。综上所述，菊花自古以来，在人民群众中的接受度就很高，深受古今中外人民的喜爱。
但是，因为现代菊花的生产经常采用扦插繁殖的方式，一些通过土壤传播的病毒害、 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
虫害等侵染菊花就会变得非常容易。[1]在这些病害中，菊花B病毒（Chrysanthemum virus B，CVB）是导致菊花品质下降的主要病毒之一，这种病毒的侵染极大地影响了菊花的观赏价值，给菊花产业带来了巨大的经济损失。
CVB病毒于20世纪50年代被Noordam发现，属于香石竹潜隐花叶病毒属。[2]CVB病毒的RNA有8000–9000个核苷酸，包含六个开放式阅读框。病毒颗粒有轻微的弯曲，杆状，长685纳米，直径12纳米。[3]该病毒的致死温度为7080℃，室温条件下的体外保毒期为6天。被花叶类病毒侵染的植物，其叶片会出现黄绿相间的斑驳状现象，严重的还会有褐色斑点甚至叶片坏死。此外叶片上还会有灰绿色的隆起。若是菊花长期采用扦插繁殖且不对这类病毒采取防治措施，菊花的产量会大大下降，菊花的品质方面也会出现种性退化的现象。菊花B病毒在菊花植株上的发病率为16.7%，除了侵害菊花以外，菊花B病毒还能侵染矮牵牛、烟草、瓜叶菊、百日草、金鱼草、金盏菊等一些植物。
植物病毒主要是RNA病毒，由于RNA的稳定性不够，直接研究病毒的RNA有一定的难度，所以需要将其反转录为DNA，在DNA的基础上进行研究。至今国外已有烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、烟草脆裂病毒、番茄不孕病毒等大量的植物病毒被成功地构建了全长cDNA侵染性克隆载体。RNA病毒的全长cDNA侵染性克隆技术的发展，使人们可以在DNA水平上开展RNA病毒的分子生物学研究，为深入地研究RNA病毒与寄主之间的相互作用机制提供了有效手段。
对CVB病毒的检测可以利用RTPCR技术进行鉴定，这对控制病毒的侵染有很重大的意义。[45]叶明在传统RTPCR技术的基础上采用一步RTPCR检测马铃薯纺锤块茎类病毒，发现一步RTPCR不仅精确度不比传统方式差，而且还更加高效。[6]在两步法RTPCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。而在一步法RTPCR中，在同时进行逆转录和PCR优化的操作下，逆转录和PCR在同一只管中顺次进行。一步法中减少了mRNA二级结构的生成过程，减少了可能造成污染的结构，而两步法中是在同一管中同时扩增两个引物，减少了一些人为的误差。
梁芳，刘瑞霞，张燕等人[7]采用RTPCR扩增菊花B病毒外壳蛋白（CP）基因的方法对他们在郑州采集到的病毒样品进行检测，从而进行序列同源性和系统进化的分析，以便研究分析菊花B病毒的变异是否频繁。研究者将NCBI上已报道的部分菊花B病毒的CP基因序列与他们得到的试验样品分离物进行比对分析，发现核苷酸序列同源性在76%～99%，氨基酸序列同源性在77%～99%。这些数据就说明菊花B病毒很有可能朝着不同的方向进化发展，多种变异方向使该病毒的防治比较棘手。
菊花CVB病毒对菊花产业的产值影响是巨大的。如果我们能在疾病症状出现之前确定是否存在CVB病毒，对控制这种疾病将是一个重要的优势。对病毒的检测不仅需要对低病毒浓度敏感，而且应该快速和具有特异性。管志勇[8]等人利用基因特异性引物获得最通用的cDNA来检测菊花中的CVB病毒。该方法不仅可以检测到病毒，而且用基因特异性引物提取的cDNA稀释量可达910倍，从而更准确地检测到病毒。
对于检测植物病毒，现在已经有了很多非常成熟的方法。之前最常用的是酶联免疫吸附实验(ELISA)，但是这种检测方法具有很高的感染性，而且敏感性相对较低，对于病毒RNA浓度较低的样品，准确性不高。[9]所以，近年来经常使用的检测方法就是上述中采用的RTPCR法。而在现有的所有类型的PCR方法中，qRTPCR是非常简单且具有很高的特异性和敏感性，它的操作程序完全自动化。qRTPCR现在已成为分子生物学技术研究的主流技术，并在植物检疫中占有重要地位[10]。

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