植物原生质体目前广泛应用于分子和生理的各类研究中，在模式植物拟南芥和许多观赏植物中，原生质体在植物功能基因组学的研究中已经起到重要作用，包括瞬时基因表达、蛋白互作、亚细胞定位等。荷花作为中国传统十大名花，兼具经济价值和观赏价值，但由于生理特性限制，原生质体制备及转化尚未在研究中得到应用。本实验在拟南芥原生质体相关研究的基础上进行荷花原生质体的制备研究。以水培的荷花幼叶作为材料，使用1.5%的纤维素酶R-10和0.4%的离析酶R-10配置酶解液进行酶解，发现酶解时间4 h原生质体产量较高,可达1.2×106个/g，且活性接近80%；同时使用PEG4000配合碱裂解法提取的高浓度PIR-GFP质粒尝试转化，观察到绿色荧光在部分原生质体中表达，表明转化体系构建成功。本研究建立的荷花原生质体制备及转化方法可为荷花基因功能研究提供重要途径。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1．1 植物材料及培养 2
1．2 实验设计 2
1．3 实验步骤 2
1．3．1 试剂的制备 2
1．3．2 材料处理及原生质体的提取 2
1．3．3 荷花原生质体计数和活力测定 3
1．3．4 荷花原生质体转化 3
2 结果与分析 4
2．1 荷花叶片原生质体的分离的最佳条件 4
2．1．1 材料及处理 4
2．1．2 酶解液组成 4
2．1．3 酶解时间对荷叶原生质体产量和活力的影响 5
2．2 荷花叶片原生质体转化 5
3 讨论 6
3．1 荷花叶片原生质体的分离的困难与应对 6
3．2 影响植物原生质体分离的因素 6
3．3 影响PEG转化植物原生质体效率的因素 7
致谢 7
参考文献 7
荷花原生质体分离和转化
引言
植物原生质体是指植物细胞壁内的原生质，即通过质壁分离能够和细胞壁分开的一部分细胞物质，包括细胞膜、细 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
胞质和细胞核。离体的原生质体给予适当条件，可以繁殖、分化、再生成完整植株[1]。原生质体由于没有细胞壁，相对容易摄取外源遗传物质，是进行遗传转化的理想受体，也是植物新品种选育的优良起始材料。1960年英国植物生理学家Cocking首次分离出有活性的原生质体[2]，1970年Takeble等首次利用烟草叶片叶肉细胞分离出的原生质体培养出了再生植株[3]，之后植物原生质体研究进展迅速，目前已有多种作物、观赏植物等建立了高效的原生质体转化体系[48]，并用于进一步的亚细胞定位、蛋白质互作、基因沉默与表达等研究[911]。
荷花(Nelumbo nucifera)为莲科多年水生草本花卉，中国传统十大名花之一，其叶片和花具有相当高的观赏价值；地下茎莲藕和种子莲子是常见的蔬菜，且荷花的全株均可入药，具有很高的经济价值[12]。但由于荷花自身的生长习性和生理特性限制，原生质体的提取步骤相对繁琐，转化效率不高且难度较大，目前还极少有研究致力于荷花原生质体的提取和转化，仅有以盆栽幼苗和无菌试管苗的展开幼叶为材料分离纯化原生质体[13]，未见进一步的研究。
本实验以以荷花叶片为材料，参照Yoo等对拟南芥的相关研究[14]配制适于荷花原生质体提取与转化的试剂，经过改良，用酶解法分离提取原生质体，探究酶解时间等因素对原生质体产量和活性的影响，找到荷花叶片原生质体分离的最佳条件；然后将带有GFP基因的病毒质粒作为载体，经PEG诱导转化，尝试建立瞬时表达体系，为今后的生理及分子方面的研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 植物材料及培养
取饱满莲子若干，用园艺修枝剪破开莲子萌发孔处，以助于莲子的破壳萌发。将破壳后的莲子置于水培专用小桶中，培养于25℃培养箱。未萌发前暗培养，萌发后置于16 h光照，8 h黑暗的培养箱中，每3天更换一次水及营养液，以保持植物生长环境的干净，否则易生菌发霉。约3周后，陆陆续续会有荷花叶片展开，待用。
1．2 实验设计
影响植物原生质体分离效果的主要因素有材料、预处理、酶液组成及酶解时间等。本实验主要针对酶解时间进行研究，按照酶解时间15 h设置五组梯度实验。采用血球计数板进行计数，用二乙酸荧光素（FDA）检测原生质体活力，最后进行PEG诱导转化。
1．3 实验步骤
1．3．1 试剂的制备
1．3．1．1 酶解液的制备 20 mM MES (pH 5.7) 加入1.5% (wt/vol)的纤维素酶R10、0.4% (wt/vol)离析酶R10、0.4 M甘露醇以及 20 mM KCl。将该溶液在55摄氏度水浴10分钟，使脱氧核糖核苷酸和蛋白酶失活，提高酶的溶解性，后室温（25℃）冷却后加入10 mM CaCl2、 15 mM β巯基乙醇以及0.1% BSA。（β巯基乙醇可根据需要决定是否添加；在酶粉加入之前，MES溶液在70℃预热35 min，最终的酶解液呈透明的浅棕色，用0.45μm注射器过滤装置将最终酶溶液过滤到50 ml离心管中。）
1．3．1．2 WI溶液的制备 4 mM MES (pH 5.7) 加入 0.5 M甘露醇和20 mM KCl。室温保存（2225℃）。
1．3．1．3 W5溶液的制备 2 mM MES (pH 5.7) 加入 154 mM NaCl、125 mM CaCl2 和5 mM KCl。室温保存（2225℃）。
1．3．1．4 MMG溶液的制备 4 mM MES (pH 5.7) 加入0.4 M 甘露醇和15 mM MgCl2。室温保存（2225℃）。
1．3．1．5 PEG转化溶液的制备 将2040% (wt/vol) PEG4000溶于ddH2O中，加入0.2 M甘露醇和100 mM CaCl2。（在转化前至少1小时制备聚乙二醇溶液以完全溶解PEG；可以在室温下储存并在5 天内使用，新制备的PEG溶液具有较好的原生质体转化效率；该溶液不需要高压灭菌。）

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