作为非编码小RNA，microRNA主要在转录后水平调控基因表达和蛋白翻译，其在植物非生物胁迫中具有重要的调控作用。花烛（Anthurium andraeanum）是花叶共赏的观赏花卉之一，深受消费者的喜爱。但是，花烛在温室栽培过程中受到各种非生物胁迫的影响，严重制约其生长发育和观赏品质。前人研究发现microRNA408（miR408）与植物的非生物胁迫密切相关。本试验对花烛miR408（Aa-miR408）进行克隆及不同非生物胁迫处理的表达分析，发现Aa-miR408响应非生物胁迫。同时，将Aa-miR408转入拟南芥，分别对转基因拟南芥和对照植株进行干旱胁迫和低温胁迫处理，比较二者生长势，发现转Aa-miR408拟南芥抗旱能力明显上升，而抗低温能力无明显变化。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法4
1.1试验材料 4
1.2试验方法 4
1.2.1 花烛材料非生物胁迫处理及RNA提取4
1.2.2 AamiR408基因克隆及载体构建5
1.2.3 农杆菌介导法转化拟南芥6
1.2.4 转AamiR408拟南芥培养6
1.2.5 筛选AamiR408过表达的拟南芥植株6
1.2.6 拟南芥非生物胁迫处理6
2 结果与分析7
2.1 AamiR408在不同非生物胁迫下的表达分析7
2.2 AamiR408克隆及茎环结构预测7
2.3 AamiR408过表达植株筛选 8
2.4 非生物胁迫处理8
2.4.1干旱胁迫处理8
2.4.2 低温胁迫处理9
2.5 总结9
3讨论10
致谢10
参考文献11
花烛microRNA408与非生物胁迫相关性研究
引言
microRNA（miRNA）是一类内生的、长度约2024个核苷酸的小RNA，可与mRNA（主要包含转录因子、信号蛋白和酶等）特异识别并结合，从而降解靶mRN *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
A、抑制翻译、甲基化，负向调控基因表达，在植物生长发育、逆境胁迫应对及其它生理生化反应中发挥着重要作用[1]。1993年，随着首个miRNA（lin4）在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中被发现[2]，植物miRNA的研究也陆续展开，大量的miRNAs在真核生物中被陆续鉴定。目前已经通过基因克隆方法在拟南芥中发现超过100个miRNAs，随后在水稻、玉米、烟草中陆续鉴定到同源miRNAs，并且确定了植物miRNAs同样具有高度保守性，但同时呈现出一定的物种间差异性以及时空表达特异性，在植物根、茎、叶、花器官和果实的生长发育及生物和非生物逆境响应中发挥着重要的调控作用[3]。
近年来，大量研究表明，植物miRNAs对非生物胁迫响应及耐受过程中发挥着重要作用，植物可在一种或多种胁迫下诱导单个或多个miRNAs表达，并以此来提高其对逆境的适应性[4]。作物在生长发育过程中，会受到各种环境因素的影响，其中包括生物胁迫（如病害及虫害等）和非生物胁迫（如干旱、高温、低温及盐碱等）。植物在受到逆境胁迫后，会调控转录水平、转录后水平、翻译以及翻译后水平来响应胁迫。植物 miRNAs作为基因表达的调控因子，在转录后水平调控其相关靶基因的表达，从而响应不同的胁迫[5]。
本实验室在前期花烛‘Sonate’组培过程中，自发突变产生叶色深绿型突变体，该突变体中花青素含量显著高于野生型。由于花青素在植物的抗逆性中扮演着重要的角色，例如抵抗紫外线的辐射，抗干旱，抗低温及抵抗病菌等[6]，突变体比野生型也表现出了较强的抗逆性。通过对突变体和野生型小RNA测序分析，本实验室已筛选出与非生物胁迫相关的同源microRNA408（miR408）基因，但不同物种中miR408对胁迫的响应机制不同，如经干旱胁迫处理后苜蓿和大麦miR408的表达量上升，而桃树和水稻miR408的表达量下降，推测不同物种miR408响应环境变化的机制是不同的[7]。
本研究拟通过克隆花烛同源miR408（AamiR408）基因及其在不同非生物胁迫下表达分析，并以过量表达AamiR408的拟南芥为材料，通过不同非生物胁迫处理，比较生理指标及相关基因表达变化，明确花烛miR408与非生物胁迫抗性的相关性，研究结果不仅可以为miR408调控非生物胁迫抗性的机理研究奠定基础，而且可以为花烛等观赏花卉生产中非生物逆境防治提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
花烛品种‘Sonate’、拟南芥哥伦比亚野生型（col）、AamiR408过表达拟南芥株系。
1.2 试验方法
1.2.1 花烛材料非生物胁迫处理及RNA提取
选取生长势相近的野生型花烛组培苗，分组并采用不同的胁迫处理。花烛生长于改良MS培养基：0.5 mg/L 6benzylaminopurine（6BA）、0.5 mg/L激动素（KT）、0.1 mg/L 1萘基乙酸（NAA）和30 g/L蔗糖。处理组中盐胁迫组中加入400 mmol 氯化钠（NaCl），渗透处理组加入20% PEG6000，氧化处理组中加入1.0 mmol H2O2，将所有植株放入4 ℃培养箱内，在12 h和24 h时各采取0.1 g的叶片利用改良CTAB法提取测定其RNA含量。重复三次处理，并分析比较。
采用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取RNA，具体步骤如下：
蛋白酶K处理枪头：将枪头、离心管中加入含蛋白酶K的ddH2O（50 μl蛋白酶K（20 mg/ml）溶于1 L ddH2O），使用摇床摇1 d，灭菌，倒出液体后烘干。研钵、研棒洗净放入瓶子，180 ℃灭菌烘干5 h以上。提前1 h打开制冰机和水浴锅（65 ℃），将镊子、研棒、研钵、枪头、移液枪、泡沫板、离心管（2 ml、1.5 ml）放入通风橱。

原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/yy/564295.html