果梅（Prunus mume Sieb. et Zucc.）是原产于中国的蔷薇科李属植物，多数品种完全花中包含一枚正常发育的雌蕊，但也有少数品种有多枚能正常发育的雌蕊，可以提高果梅价值。WUS维持着花分生组织中干细胞的活性，要使干细胞增长停止，需要使WUS表达停止，而其中关键因子正是AG。AG对WUS的调控机制值得研究。本实验采用原位杂交技术，分别制作AG和WUS原位杂交探针，对果梅单雌蕊品种“青佳2号”（QJN2）和多雌蕊品种“大羽”（DY）不同时期组织内AG和WUS定位检测并分析其表达量，从而推测出AG和WUS在花发育过程中起到的作用及其调控作用是否受其表达量影响。为后续进一步探究果梅多雌蕊形成的分子机制提供参考依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 植物材料 2
1.2 果梅AG原位杂交探针制备2
1.2.1 AG基因片段的克隆2
1.2.2 目的基因片段的回收、连接及转化3
1.2.3 双酶切鉴定3
1.2.4 探针制备4
1.3 WUS原位杂交探针制备4
1.4 AG和WUS原位杂交5
1.5 总RNA的提取及第一链cDNA的合成5
1.6 AG和WUS实时荧光定量PCR分析6
2 结果与分析7
2.1 探针制备 7
2.2 AG和WUS的原位表达9
2.3 RNA提取分析9
2.4 AG和WUS基因的时空表达模式10
3 讨论 11
3.1 AG和WUS作用机理探讨11
3.2 原位杂交结果存在的问题 12
致谢12
参考文献12
图1 AG和WUS片段克隆8
图2 AG和WUS质粒提取8
图3 WUS和AG探针制备9
图4 QJN2和DY花芽WUS（a）和AG（b）原位杂交9
图5 QJN2和DY花芽部分时期RNA10
图6 AG和WU *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
S在梅花雌蕊发育过程中的时空表达10
表1 AG和WUS原位杂交引物3
表2 qRTPCR试验的引物设计7
WUS及AG在果梅不同雌蕊品种中的表达部位分析
引言
引言
果梅（Prunus mume Sieb. et Zucc.）是原产于中国的蔷薇科李属植物，具有较高的观赏、营养价值[1]。梅完全花中一般包含一枚正常发育的雌蕊，但也有诸如“品字梅”等少数品种具有三枚及以上的雌蕊，且授粉后能够正常发育而形成一花多果，这样的品种通常具有更高的观赏价值以及经济价值。并且果梅中这一性状通常为整个树体的花都有表现，因此这类多雌蕊现象非环境因素诱导而来自于基因遗传，其分子机制值得探索。然而目前关于果梅多雌蕊现象研究报告较少，研究多集中在水稻、小麦等粮食作物中[28]。通过参考相关研究，可大致推测出多雌蕊形成分子机制的研究方向，找到影响多雌蕊现象形成的关键因子。
花分生组织中要保持干细胞的活性，WUSCHEL（WUS）在其中的作用至关重要，因而WUS必须在适当时期停止表达才能使分生组织中干细胞的增长停止，使其发育成心皮，从而保证其有性繁殖。研究发现AGAMOUS（AG）是抑制WUS表达从而使花分生组织停止所必须的，而其他基因的单突变体中均不能使花分生组织停止完全消失[9]。
原位杂交是一种分子生物学技术。该技术基于细胞水平，研究作为实验对象的细胞组织或染色体内特定基因时空表达模式。其基本原理是根据碱基序列互补规则，引导待测DNA或RNA与所引入的外源核酸（也称探针）互补配对，成为专一核酸杂交分子，再采用相应的检测手段将其位置呈现出来。其分支之一的RNA原位杂交技术主要用于组织或细胞内RNA表达的检测，探针一般为cRNA或寡核苷酸。其发展迅速，实际运用广泛，在基因分析和诊断上定性、定位和定量分析方面的使用尤其出色。
关于植物发育的研究中，原位杂交技术被广泛应用。陈芳芳[10]在关于山核桃成花基因的研究中，为对花芽组织中CCLFY基因进行定位，综合运用RTPCR技术和RNA原位杂交技术，用以检测不同时期CCLFY的杂交信号，再通过不同时期信号强度差异分析该基因在山核桃花发育过程中的作用。陈起振[11]通过原位杂交技术对白菜五级花蕾中BcNS基因定位检测，为之后进一步明确BcNS基因提供探索方向。在有关毛竹的研究中，程占超[12]为推断毛竹中ABCDE模型是否成立，应用原位杂交技术，使花器官内MADSbox基因的用途得以明确。为了解毛竹的花发育过程中相关基因时空表达模式，张颖[13]设计了相应基因的反义RNA探针，通过与毛竹石蜡切片（由不同时期花发育器官制作）进行原位杂交检测其表达情况，以此分析该基因对毛竹花发育的意义。由于原位杂交拥有的精确定位功能，在花发育的相关研究中其重要性无可替代。
RNA原位杂交技术是本实验的关键。通过克隆、回收、连接及转化AG基因片段，制备AG原位杂交探针；对WUS基因序列进行PCR扩增，制备WUS原位杂交探针；对AG和WUS进行原位杂交和实时荧光定量PCR分析，从而得出其原位表达和时空表达情况，根据不同时期花芽中AG和WUS表达部位及表达量的变化情况推测AG与WUS之间存在何种相互关系，进而分析AG是否在某一时期起到抑制WUS的作用，为进一步探索梅多雌蕊形成分子机制提供参考。
1 材料与方法
1.1 植物材料
试验用植物材料来自国家果梅种质资源圃（江苏，南京）。分别于2018年9月、10月、11月采取单雌蕊品种“青佳2号”（QJN2）和多雌蕊品种“大羽”（DY）不同时期的花芽，并去除其外层鳞片，迅速冰冻保存，冻结液为液氮，在70°C环境（冰箱）下，备用。选择雌蕊分化初期和分化期的花芽为材料进行原位杂交，花芽材料用FAA固定液固定。

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