通过用外源ABA、乙烯利和1-MCP处理‘翠冠’梨果实，明确了外源ABA和乙烯对‘翠冠’梨果实外观和内在品质发育的调控作用；通过对乙烯与1-MCP处理的翠冠梨进行转录组测序，从而建立了梨果实成熟过程中的基因表达谱数据库，乙烯处理筛选到4654个差异基因，1-MCP筛选到2235个差异基因，进而发现差异基因ERF家族成员PbrERF1乙烯处理上调，1-MCP处理下调；通过qRT-PCR检测，PbrERF1基因的表达趋势与转录组相吻合；同时，通过qRT-PCR验证候选基因PbrERF1在多个梨品种成熟期显著上调；利用双荧光素酶系统检测PbrERF1基因对上游乙烯合成基因PbrACS688和PbrACO54转录调控关系发现，PbrERF1转录调控ACC合成酶PbrACS688，而对ACC氧化酶PbrACO54没有调控作用，初步确定一个调控梨果实成熟的乙烯响应因子PbrERF1基因。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 外源ABA、乙烯利以及1MCP处理翠冠梨果实2
1.1.1 ABA处理2
1.1.2 乙烯利和1MCP处理2
1.2 转录组测序与关键基因的筛选3
1.3 实时定量RTPCR3
1.4 原生质体分离与双荧光素酶报告分析4
2 结果与分析4
2.1 外源ABA和乙烯处理4
2.2 乙烯合成基因与乙烯响应因子的筛选6
2.3 荧光定量PCR检验6
2.3.1 RNA提取及反转录cDNA6
2.3.2 qRTPCR验证候选基因7
2.3.3 多品种验证PbrERF1表达 7
2.4 验证PbrERF1转录调控PbrACS688与PbrACO547
2.4.1 基因克隆及载体构建7
2.4.2 双荧光素酶报告基因（DLR）8
3 讨论8
3.1 ABA和乙烯的调控效果8
3.2 响应梨果实成熟的相关基因8
3.3 乙烯响应因子ERF调 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
控果实成熟9
致谢9
参考文献9
ABA和乙烯对’翠冠’梨果实的生长发育及成熟的影响
引言
近年来大量研究表明，果实的生长发育及成熟受到植物激素不同方面不同程度的影响，尤其在五大类植物激素中，不仅是乙烯，其他激素如脱落酸（ABA），生长素（IAA），赤霉素（GA）及细胞分裂素（CTK）都有参与，但它们的调控机理至今尚不明确。
果实成熟是一种非常重要的农艺性状，是人类直观判断风味和可食用产品的关键。大多数梨属于呼吸跃变型果实，在果实成熟的过程中有大量乙烯的释放，同时外源乙烯能够促进呼吸跃变型果实的成熟。随着对果实成熟生理研究的不断深入，人们越来越认识到果实的成熟实际受基因的控制，而植物激素可能是这些成熟基因表达的启动因子。
乙烯是人们公认的果实成熟衰老激素。在果实后期成熟衰老的过程中，乙烯的变化最为明显，众多学者也对其在果实后期成熟衰老过程中的调控机理也进行了研究。其中在呼吸跃变型果实中，乙烯的产生有一个明显的上升期和高峰，与其呼吸跃变模式相似。
乙烯在果实的成熟阶段起作用，是参与果实成熟和衰老的重要激素。在生产上，人们通过外施乙烯来达到促进果实成熟的效果。乙烯大量存在的情况下，能够加速果实的完熟进程。如未成熟的香蕉经过运输后使用乙烯催熟然后上市。大多数梨属于呼吸跃变型果实，在成熟过程中呼吸速率会出现明显的高峰。
乙烯可以在植株许多部位产生，包括根、茎、叶、花、果实和种子等，产生部位的生长素浓度、受伤情况以及外界条件的刺激都可能影响乙烯的产生。其生理作用是可刺激植物细胞膜透性，促进相关RNA 的合成，并且是碳水化合物转化酶的调节开关，进而促进果实的成熟、衰老与脱落。在果实成熟过程中，乙烯的作用主要是加速了果实的软化阶段，而与软化阶段的启动无明显关系。促进或抑制采后果实的内源乙烯生成，可人为加速或延缓果实的后熟软化进程。
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图为ACS、ACO和ERF的互作机理
Fig The interaction mechanism of ACS, ACO and ERF.
果实成熟的机制是一个非常复杂的过程。在呼吸跃变型果实中，乙烯的合成主要通过1氨基环丙烷1羧酸合成酶（1aminocyclopropane1carboxyla synthase; ACS）催化S腺苷甲硫氨酸（Sadenosylmethionine; SAM）转变为1氨基环丙烷1羧酸（ACC），经1氨基环丙烷1羧酸氧化酶（1aminocyclopropane1carboxyla oxidase; ACO）氧化作用形成。合成的乙烯与受体（ETR或ERS）结合后激活了组成型的三重反应（Constitutive triple response; CTR），诱导了乙烯敏感蛋白的表达（ethylene insensitive protein; EIN/EIL），EIN/EIL蛋白直接结合启动子区结构元件促进乙烯响应因子（Ethylene response factor; ERF）的表达；最终，ERF调控多种性状决定基因响应果实的成熟[1][2][3]。
ABA（脱落酸，abscisic acid）这种物质最早是在 1967 年，被命名为脱落酸。在当时，人们大多认为它主要参与调控植物叶片的脱落，后来的研究表明，ABA 并不是脱落的主要调控因子，而主要的诱导物质是乙烯。此外，ABA 仅能诱导少数植物器官的脱落，在参与过程的主要作用是促进乙烯的释放，增加器官对乙烯的敏感性。众所周知，ABA 参与果实的生长发育，但其参与果实成熟的分子调控机制并不明确，ABA 在果实发育过程中起重要作用，但目前还缺乏分子遗传方面的证据支持。
大量试验表明，外源 ABA 处理能够促进果实后熟衰老过程中乙烯的生成、呼吸速率的升高以及果实的完熟。而无论是在呼吸跃变型果实，还是在非跃变型果实的成熟过程中，ABA都有促进作用。许多果实发育后期的ABA 含量都有一个明显的下降过程，而在其后的果实贮藏过程中，ABA 含量又有一个累积的过程，最后形成一个高峰，之后缓慢下降，与跃变型果实中乙烯的变化规律相似。ABA 参与了果实成熟的启动过程，可能是在果实成熟过程中位于乙烯之前的调节因子[4]。
1 材料与方法
1．1 外源ABA、乙烯利以及1MCP处理翠冠梨果实
翠冠材料来源江苏句容市茅山镇丁庄村曹庄梨基地。
1．1．1 ABA处理

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