葡萄品种鉴定是保护葡萄种质资源、研究和开发葡萄新品种、确保引种安全性和可靠性的重要手段。传统的品种鉴定方法易受环境的影响，且鉴定时间长，无法很好地区分亲缘关系相近的相似品种。本研究选用了9对SSR引物，运用分子标记技术对106个中国自育葡萄品种进行遗传分析，根据不同品种的特异性条带通过人工绘制植物品种鉴别图(Manual Cultivar Identification Diagram, MCID) 的方法，结果表明用8对引物就能在分子水平上对106个中国自育葡萄品种进行区分，根据鉴定图可直观地找到鉴别两个品种所需的引物和多态性条带长度。本研究验证了MCID法鉴定葡萄品种的可行性，以期为今后葡萄品种的鉴定、区分提供参考，并为安全引进外来葡萄品种、鉴定引进品种真伪奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法4
1.1实验材料 4
1.1.1植物材料 4
1.1.2 PCR引物 5
1.2实验方法 5
1.2.1提取DNA5
1.2.2 DNA质量检测5
1.2.3 PCR扩增6
1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶6
1.2.5 数据统计与分析6
1.2.6 人工绘制品种鉴定图6
2 结果与分析6
2.1 提取基因组DNA质量检测6
2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果7
2.3遗传相似系数与聚类分析7
2.4 106个中国自育葡萄品种鉴定8
3 讨论 11
致谢12
参考文献12
图1 部分葡萄品种基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图6
图2 引物VVMD27、VVS2、VrZAG62、VrZAG79对部分品种扩增结果7
图3 106个中国自育葡萄品种的聚类图 8
图4 106个中国自育葡萄品种的人工绘制品种鉴别图10
表1 106个中国自育葡萄品种4
表2 SSR引物序列5
106份中国自 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
育葡萄种质鉴定
引言
葡萄为葡萄科(Vitaceae)葡萄属(Vitis L.)的藤本植物，在全世界范围内大面积栽培，按用途可分为鲜食、酿酒、制干等，由于其本身清爽甘甜的口感和经过加工后富有层次的醇厚风味深受人们喜爱，是在世界范围内占据重要地位的果树之一。葡萄种类和品种繁多，还包含很多芽变等突变得来的突变品种，随着栽培范围不断扩大，葡萄也在各栽培地区形成了该区域特有的地方种群，明确葡萄种质的品种及其所属的种群是葡萄品种创新育种过程中必不可少的一环。品种鉴别的传统方法有形态学鉴定和生物化学鉴定。生物化学鉴定往往包括同工酶谱鉴定、蛋白质标记鉴定等，但这些传统方法对植物生长环境敏感，易受环境的影响，且鉴定时间长，无法很好地区分亲缘关系相近的相似品种。近年来，分子生物学技术不断发展日益成熟，从基因水平分析遗传物质并据此鉴别、区分不同品种逐渐成为可能，并取得了一定成果。
SSR(simple sequence repeat)即简单重复序列，又称微卫星DNA，是一类由16个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。每个SSR两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列，是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，由Moore等于1991年创立[1]，使用时需要根据SSR两端的保守互补序列设计1对特异引物，利用PCR对其进行扩增，扩增片段长度由于重复序列的不同而不同，因此具有丰富的多态性。SSR分子标记的优点包括多态性高、包含信息量大、重复性强、操作简便、对DNA质量要求低、呈共显性遗传等优点，目前SSR标记已经成为分子标记技术的热点，在国内外研究中得到了广泛的应用。
经过Thomas、Bowers和Sefc等人的研究，1993年1999年期间陆续报道了VVS2、VVMD5、VVMD7、VVMD32、VVMD28、VVMD27、VVMD25、VrZAG79和VrZAG62等适用于葡萄品种鉴定的SSR引物[2]。Savage等2001对41份鲜食无核葡萄种质或与鲜食无核葡萄种质名字相近的葡萄种质进行SSR分析，提出SSR技术可以有效校正品种错误并鉴定新品种[6]。Lefort等使用SSR分子标记，采用 11对SSR引物对50个希腊葡萄品种(包括鲜食品种和酿酒品种)进行了品种鉴定和遗传特性的研究[7]。BaleirasCouto等应用6个细胞核和2个叶绿体两种微卫星标记对5份葡萄种质 (Touriga Franca、Fernao Pires、Tinta barca、Tinto Cao和Marselan) 的果实和葡萄酒进行了分析,提出了量化多品种杂种中各品种比例的可能，首次提出叶绿体基因组短DNA片段标记可以有效检测葡萄酒DNA，可用于控制葡萄酒质量及检测葡萄酒造假[8]。Riaz Summaira等于2008年首次使用SSR分子标记技术分析北美麝香葡萄栽培及杂交品种，研究使用14对SSR标记对57个葡萄品种进行鉴定并绘制了指纹图谱，通过比较亲本和子代的共享等位基因，验证了已发表品种的育种记录[9]。Marinoni 等为了鉴定来自利古里亚(意大利西北部)的葡萄品种，将51个葡萄品种与邻近地区有记录的葡萄品种进行比较，SSR分析只发现了36个独特的遗传图谱，说明同一地区或其他葡萄产区的葡萄品种出现了同物异名的品种[10]。Kanghee C等利用28个SSR引物鉴定了30个葡萄品种，研究表明Jinok与康拜尔早生相似系数为1，可能为同一品种，同时仅用VVIt60, VVIn61, VVIu20就可将其余28个葡萄品种加以区分[11]。2015年Mihaljevic等分析了克罗地亚和黑山(欧洲东南部)的284个地方葡萄品种，共使用9对SSR引物，发现了25个之前未曾报道过的基因型，并将得到的数据与欧洲数据库以及其他已报道的相关研究结果进行比对，发现了一些新的同名异物和同物异名品种[12]。
2005年后，国内以葡萄为实验材料使用SSR分子标记技术的研究也逐渐增多，研究方向包括筛选适用于葡萄的SSR引物，优化葡萄SSR反应体系，分析葡萄种质的遗传关系、鉴定葡萄品种等。2005年姚玉新等先选择RAPD引物将14个酿酒葡萄品种分为四个类群，再利用SSR分子标记对‘蛇龙珠’、‘赤霞珠’、‘品丽珠’及‘美乐’所在的类群进行遗传关系分析，结果表明是美乐与品丽珠遗传距离最小，赤霞珠和品丽珠遗传距离最大[13]。吴子龙等利用9对SSR引物对8个山葡萄及山欧杂种葡萄品种进行分析并区分开来，其中引物UDV067提供的信息量最大[14][15]。2006年，吴子龙选择山葡萄为实验材料，通过9个SSR位点区分了8个山葡萄品种，其中UDV067提供的信息最多，VMC7b1提供的信息最少；利用26对引物对124份山葡萄种质聚类分析，结果表明6大山葡萄类群多数符合地理分布。郝宇等筛选了12对引物将39份葡萄种质分为了三大类群[16]。陈姝等对比SSR和RAPD两种分子标记技术分析云南的41个野生蘡薁葡萄品种，发现两种分子标记都可以区分不同品种差异，但RAPD标记对遗传距离较近的群体间差异更敏感[17]。樊秀彩等筛选出7对能扩增出父本特异条带的引物，用SSR分子标记结合形态学分析的方法，对山葡萄和河岸葡萄种间杂交后代进行鉴定，结果表明，杂交后代中有161株是真杂种，后代中还产生了新条带，因此认为SSR标记可有效地对葡萄属种间杂种进行鉴定从而创新葡萄种质资源[18]。杜晶晶采用改良的CTAB法提取DNA，加入了PVP和β巯基乙醇去除多酚类物质，建立葡萄SSRPCR反应的适宜体系(20μL)：1.6μLdNTP (2.5mmol/L)、1.2μL Mg2+(25mmol/L)、2μL10×PCR buffer、正/反向引物各1μL(10mmol/L)、1μL模板DNA(30ng/μL)、0.2μLTaq酶(5U/L)和12μLddH2O，应用9对SSR引物鉴别、区分了80个葡萄品种，构建了80份葡萄种质的有效分子身份证用于后续葡萄品种鉴定[19]。李慧等利用SSR分子标记和IRAP分子标记对‘关口葡萄’的亲缘关系进行了分析，采用另外14份葡萄种质为对照对‘关口葡萄’的身份进行鉴定，结果表明‘关口葡萄’与欧美杂种‘尼加拉’和‘白香蕉’亲缘关系最近，不是‘尼加拉’或‘白香蕉’中的任何一种，但其来源可能与上述两个品种有关[20]。郭春苗等以新疆44个适宜制干的葡萄品种(系)为材料，利用Vmc9a2.1,UDV017,UDV033和UDV041四条引物构建了品种DNA指纹图谱，可将44份葡萄种质区分开来[21]。尹玲等对我国自育的24份葡萄种质材料进行了SSR分析，结果表明，所用的6对引物除了可以明确地区分开供试葡萄品种，还可以鉴定出品种的倍性，分析品种间的亲缘关系[22]。苏聪聪等利用SSR标记对种间杂交种的F1后代进行真实性鉴定，可以作为葡萄种植创新的分子辅助方法[23]。马文瑞[24]、孙明君[25]等以酿酒葡萄品种为试验材料，董志刚[26]则以山西省农业科学院果树研究所自育葡萄品种及其亲本为材料，建立基于SSR标记的品种鉴别、亲本鉴定体系。

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