43ABSTRACT: 43引言 541 材料与方法 1081.1 植物材料、化学试剂、表达载体与菌株 1081.2 CNTCP2基因克隆 1081.3 菊花脑CNTCP2基因的亚细胞定位 1081.3.1 载体构建 1081.3.2 洋葱表皮细胞瞬时表达 1181.4 菊花脑CNTCP2基因的转录激活活性分析 1191.4.1 载体构建 1191.4.2 酵母转化 1291.5 CNTCP2转录激活活性分析 12101.6 CNTCP2基因转化拟南芥及功能验证 12101.6.1 遗传转化拟南芥 12102 结果与分析 13112.1 CNTCP2的克隆与生物信息学分析 13112.2 CNTCP2的亚细胞定位 14122.3 CNTCP2的转录激活活性分析 15132.4 CNTCP2的在拟南芥中的功能分析 15132.5 CNTCP2转基因拟南芥中细胞分裂相关基因的表达情况CNTCP2转基因拟南芥细胞分裂相关基因的表达分析 17153 讨论 1816致谢17参考文献 1918附录 2122引言 41 材料与方法 91.1 植物材料、化学试剂、表达载体与菌株 91.2 CnTCP2基因克隆 91.3 菊花脑CnTCP2基因的亚细胞定位 91.3.1 载体构建 91.3.2 洋葱表皮细胞瞬时表达 101.4 菊花脑CnTCP2基因的转录激活活性分析 101.4.1 载体构建 101.4.2 酵母转化 111.5 CnTCP2转录激活活性分析 111.6 CnTCP2基因转化拟南芥及功能验证 111.6.1 遗传转化拟南芥 112 结果与分析 122.1 CnTCP2的克隆与生物信息学分析 122.2 CnTCP2的亚细胞定位 132.3 CnTCP2的转录激活活性分析 142.4 CnTCP2的在拟南芥中的功能分析 142.5 CnTCP2转基因拟南芥细胞分裂相关基因的表达分析 163 讨论 17参考文献 18附录 20附录一 RNA提取 20附录二 消化基因组DNA与第一链cDNA合成和检测 21附录三 cDNA全长序列的获得 23附录五 目的片段连接转化及重组子筛选、测序 25附录六 质粒提取 26附录七 基因序列 27附录八 实时荧光定量实验（qRT-PCR） 29附 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
录九 LR重组法构建载体 30附录十 酵母感受态细胞的制备及转化 32附录十一 农杆菌感受态细胞的制备及冻融法转化农杆菌 34附录十二 农杆菌转化拟南芥 35菊花脑CnTCP2的克隆及功能鉴定本研究克隆获得了菊花脑TCP家族基因CnTCP2。通过系统进化树和氨基酸序列的详细比对分析后发现，CnTCP2蛋白属于TCP转录因子家族中的Class II亚类中的CIN类，包含了一个非典型的bHLH结构域。CnTCP2定位在细胞核，无转录激活活性。超表达CnTCP2拟南芥表型出现植株和叶片变小，成丛生状，莲座叶数目明显增多，抽薹时间推迟，花变大，花瓣变长。RT-PCR分析显示，拟南芥中超表达CnTCP2后，叶片中AtCDKD;1和AtCYCB2;4基因表达下调，AtCDKC;1、AtKRP5和AtE2F3基因表达上调。
目录
引言
转录因子（transcription factor, TF）又叫做反式作用因子（transacting factor），是指一种能够特异性地结合基因启动子区顺式作用元件的DNA结合蛋白。通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用，可以激活或抑制靶基因的转录，从而调控靶基因的表达水平。TCP转录因子家族是植物体内特有的一类转录因子，能够参与植物生长发育相关的调控。它主要在分生组织中起作用，与细胞的分化和生长过程联系十分紧密。TCP转录因子有一个TCP结构域，该结构域是由59个氨基酸构成的非典型的bHLH（non canonical basicHelixLoopHelix）结构，即螺旋环螺旋结构。CYC和TB1的bHLH结构域中basic区域含有21个氨基酸和核定位信号（nuclear localisation signal，NLS）。根据结构域的不同，TCP可以分为2个亚类：Class I（PCF类或TCPP类）和Class II（TCPC类）。Class I以水稻的PCF1和PCF2为代表，Class II以CYC和TB1为代表（图1和图2）。Class I与Class II蛋白的最大差别在于basic区域缺失了4个氨基酸（图2）。除TCP结构域外，其他的motifs是保守的，如1820个富含精氨酸残基的motif（R结构域，图1）和谷氨酸半胱氨酸谷氨酸的ECE motif [1]。
图1 TCP基因家族 [2]
Figure 1 The TCP gene family [2] 
在被子植物中，Class I是由一组关系相对密切的蛋白组成，而Class II因TCP结构域的不同进一步分为两亚类（图1和图2）。CIN类如金鱼草CINCINNATA（CIN），包含参与侧向器官发育的基因[3, 4, 5, 6]，CYC/TB1类（ECE类）基因中大部分主要参与花或侧枝腋生分生组织的形成等生长发育过程。CIN类比CYC/TB1类原始，因为没花或侧枝的Selaginella和Physcomitrella的Class II成员都属于CIN类 [7]。CYC/TB1类可能在被子植物之后进化而来。在单子叶植物中，tb1基因及其同源物控制生殖和营养器官（花序、花和侧芽）的生长及发育[8, 9, 10, 11]。系统进化发育分析数据中显示，CYC/TB1类基因在其进化过程中，基础的关键核心区域发生过两次基因复制，从而形成了CYC1、CYC2和CYC3三种类型的基因[12]。拟南芥遗传研究表明CYC1亚类保留了tb1控制侧枝发育的功能[13, 14]。CYC2亚类包括CYCLOIDEAlike（CYClike）基因，在花的不对称（zygomorphy）进化中起着关键的作用[15, 16]。CYC3亚类含有的基因，如拟南芥BRANCHED2（BRC2）基因主要在侧枝以及花原基中表达，并在分枝的形成过程中起微弱的调控作用，但在花发育中的作用尚不明确[13]。
图 2 不同物种TCP家族成员的氨基酸序列比对 [2]
Figure 2 Alignment of the predicted amino acid sequence from selected members of the
TCP family [2]
TCP蛋白可以形成同源和异源二聚物[17]。各种类型的异聚体组合能够结合不同的顺式作用元件，识别具有不同亲和力或不同功能的靶基因或调节彼此的转录激活/抑制活性[18]。TCP转录因子作为一类DNA结合蛋白，我们可以预测其定位在细胞核上。事实上，一些TCP家族成员已经证实定位在细胞核[19, 20]。
研究表明，TCP转录因子中的Class I和Class II基因具有相反功能，Class I基因促进植物生长和细胞增殖，Class II基因抑制植物生长和细胞增殖[2]。
TCP家族蛋白能够结合一部分基因启动子的功能性顺式作用元件，从而起到转录激活/抑制的作用，从而调节基因的表达[20]。TCP结合位点能与拟南芥CYCLINB1;1（AtCYCB1;1）基因启动子的M特异性激活子（MSA）元件（控制细胞分裂G2/M期特异性表达时间）结合，促进基因的表达[21, 22]。TCP结合位点能与AtPCNA2，AtCYTOCHROME C1/2和大量核糖体蛋白基因启动子的顺式元件telo box结合[23, 24, 25]，甚至可以与人工合成的telo box启动子协同作用，从而能够激活下游报告基因的表达[23]。一些TCP蛋白参与形成转录复合物，酵母双杂验证AtPURa与AtTCP20互作，这两个蛋白共同作用于核糖体蛋白基因的启动子 [23]。TCP转录因子CCA1 HIKING EXPEDITION（CHE）与CCA1启动子结合抑制基因表达[20]，与CCA1转录激活基因TIMING OF CAB EXPRESSION1（TOC1）相互作用[26]。AtTCP24和Armadillo BTB拟南芥蛋白（ABAP1）形成复合物，与AtCDT1a和AtCDT1b启动子结合，抑制基因表达[27]。
Class I中的TCP转录因子代表为PCF类基因。水稻分生组织中，PCF1/PCF2蛋白结合到PCNA（proliferating cell nuclear antigen）基因启动子上，激活基因的表达进而促进细胞增殖[28]。拟南芥AtTCP20能够结合AtCYCB1;1基因启动子中的GCCCR作用元件，从而促进基因表达，进一步使细胞发生增殖[22]。另外，拟南芥AtTCP20还可以通过结合PCNA2基因启动子区域的顺式作用元件TGGGCC/T，激活PCNA2基因的表达并进一步促进细胞的增殖过程[23]。拟南芥TCP14和TCP15基因通过促进幼苗节间细胞分裂来影响植物的大小，通过SRDX融合技术共同抑制TCP14和TCP15基因表达，萼片和心皮不能正常发育，几乎没有花瓣[29]。拟南芥TCP15能与IAA3/SHY2和SAUR65基因的启动子结合，也可能与CINlike TCP蛋白相互作用，通过对生长素路径相关特异性表达基因的调控，促进细胞的生长和增殖[30]。

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