‘砀山酥梨’( Pyrus bretschneideri ‘Dangshansuli’)是广受市场欢迎的一种水果，但是果实内石细胞含量较多，严重降低了果实品质和口感。目前的研究和生产应用可以证明，经CaCl2处理后，‘砀山酥梨’果实内的木质素合成和石细胞形成受到抑制。但是，田间处理中存在多种因素同时影响结果，很难控制单一影响因素。然而，利用严格控制了培养基与培养条件的植物离体愈伤组织系统，可以在任何时间研究某单一因素对结果的影响。同时，葡萄、番茄、石榴等植物已建立完整的愈伤组织和细胞悬浮培养体系。因此，本试验以幼果期砀山酥梨的果肉为外植体，进行愈伤组织诱导和继代培养，初步建立细胞悬浮体系。为进一步研究Ca2+在木质素形成过程中的流向以及钙处理对石细胞、木质素含量的影响提供新途径。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法5
1.1 试验材料 5
1.2 试验方法 5
1.2.1 梨果实愈伤组织的诱导5
1.2.2 维生素C浓度对梨果实愈伤组织褐化的影响6
1.2.3 愈伤组织生长量的测定6
1.2.4 细胞悬浮体系相关指标的测定6
1.2.4.1 悬浮细胞质量的测定6
1.2.4.2 细胞密度测定7
1.2.4.3 细胞活力的测定7
2 结果与分析7
2.1 砀山酥梨果肉愈伤组织诱导7
2.2 不同浓度Vc对愈伤组织褐化的影响8
2.3 继代培养基对愈伤组织生长量的影响8
2.4 悬浮细胞质量的变化9
2.5 细胞密度的变化10
2.6 细胞活力的变化11
3 讨论12
参考文献12
‘砀山酥梨’细胞悬浮培养体系的建立
引言
引言
中国是梨生产第一大国，拥有丰富的梨种质资源。‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri ‘Dangshansuli’)属于白梨品种，是我国传统的主要栽培品种之一，深受国内外消费 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
者的喜爱。砀山酥梨果肉疏松，汁多味甜，但是果心周围有大颗粒石细胞，影响了梨果实的口感。石细胞是由木质素在植物细胞壁上沉积形成的。石细胞含量是影响梨果实品质的重要因素之一[1]。
目前已有足够的研究和生产应用[24]，可以证明叶面喷施钙肥能够部分抑制石细胞的形成，提高梨果实品质。李疆等证明，在梨果实生长前期，叶面喷施0.5 %的CaCl2，能抑制多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性，并且不同程度的降低了石细胞的大小、密度和含量[4]。Lee（2007）等也发现，叶面喷施0.5%的CaCl2能够显著降低细胞质及细胞壁过氧化物酶活性，进而减少石细胞的形成[5]。经CaCl2处理后，‘砀山酥梨’果实中细胞质和细胞壁结合过氧化物酶活性都显著降低，同时木质素合成也受到抑制[6]。但是Eduardo（1998）研究发现，在植物应激反应中，细胞壁钙库中的钙内流能够激活过氧化物酶(POD)，催化NADH氧化成NAD+,并产生H2O2[7]。在给梨施用钙处理以后，钙可能没有流入细胞质，而流到其他部位。因此，探明Ca2+在木质素形成过程中的流向及其对果实中过氧化物酶和木质素合成的影响，对减少梨中石细胞的含量，改善梨品质有重要意义。
在对梨进行田间钙处理时，同时存在多种因素影响试验结果，很难控制并研究单一因素影响下的试验结果。在实验室的室内条件下，可以利用植物离体愈伤组织系统，控制培养基成分与培养条件，获得稳定的试验系统。目前番茄[8]、葡萄[9]、石榴[10]、枇杷[11]、紫苏[12]等植物已建立完整的愈伤组织和细胞悬浮培养体系。因此，建立稳定的梨愈伤组织和细胞悬浮培养系统，就可以在任何时间研究某单一因素对试验结果的影响。同时，通过建立梨细胞悬浮体系可以获取有活性的单个细胞，使利用荧光指示剂结合激光共聚焦显微技术或者CCD(Charge coupled device)摄像技术进行细胞质内钙离子动态成像活动成为可能[13]。不但能够得到特定细微结构及组织荧光图像，而且能够捕捉到细胞进行生理活动过程中特定结构以及化学组分的细微变化[14]。
植物细胞培养是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、胚胎、原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导产生愈伤组织或潜伏芽，或长成完整的植株的技术[15]。植物细胞悬浮培养是指植物的细胞和小的细胞聚集体悬浮在液体培养基中进行培养，使之在体外能生长、发育，并在培养过程中保持很好的分散性[16]。愈伤组织是植物在受伤的部位，由于组织代谢发生紊乱，诱导内源生长素与细胞分裂素的合成，或在外源生长素与细胞分裂素的作用下，细胞发生脱分化作用，逐渐形成的组织团块，主要是薄壁细胞[17]。愈伤组织根据形态可分为紧密型愈伤组织和松脆型愈伤组织，后者形态疏松，易分散成单个细胞和小细胞团。松脆型愈伤组织经过振荡液体培养，可以得到悬浮细胞培养物。
与固体培养相比，植物细胞悬浮培养的优点有分散性好，细胞形状及细胞团大小一致，生长迅速，重复性好，易于控制等[18]。并且细胞悬浮培养可以使细胞充分接触培养基，最大限度地利用养分的同时，不间断地保证良好通气。通常情况下，植物细胞悬浮培养可以在短时间内获得大量细胞和高含量的细胞代谢产物。植物细胞悬浮培养的缺点在于：在不适宜的培养液和浓度下，植物细胞生长较缓慢，易出现聚堆、结块现象[18]。植物细胞分裂、增长的速度比微生物细胞的慢，需要更长的培养时间，而长时间的无菌培养存在一定难度。植物细胞内的大液泡使其对剪切力非常敏感，为保证相对低的剪切力条件，需要控制摇床转速。摇床转速过低会造成液体培养基混合不充分，影响营养物质的利用；而摇床转速过高，过高的供氧量会抑制植物细胞生长和细胞代谢产物合成。
细胞悬浮培养体系广泛应用于体细胞突变体筛选、植物的原生质体培养、多倍体诱导的倍性育种、研究代谢物的生物合成、生产次生代谢物、生产人工种子等。目前多种植物已经建立了完整的愈伤组织和细胞悬浮培养体系。杜晓映[9]利用葡萄的果皮和幼茎为材料，建立了三种葡萄的悬浮培养体系，研究了蔗糖、苯丙氨酸、茉莉酸甲酯、紫外光等诱导对悬浮细胞多酚合成的影响。程江华[10]利用石榴靠近顶端的成熟叶片诱导了疏松愈伤组织，建立了石榴细胞悬浮培养体系，研究了体系中黄酮类化合物的积累。刘小英[11]利用枇杷早钟6号的幼胚，建立并优化了适合熊果酸、齐墩果酸积累的悬浮培养体系。姜云斌等[19]以番茄的子叶为外植体，确认了番茄愈伤组织及细胞悬浮培养的最佳培养条件。周川云[20]利用以耳齿紫苏的子叶为外植体，对愈伤组织进行了悬浮培养。陈发棣等[21]利用小菊悬浮细胞，进行体外培养，成功再生出植株。可用于抗癌的紫杉醇是从红豆杉植物中提取分离出来的，利用细胞悬浮培养可以大规模生产紫杉醇[22]。

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