解淀粉芽孢杆菌SQR9（Bacillus amyloliquefaciens SQR9）是本实验室从健康黄瓜植株根际分离的一株根际促生菌，研究发现它能显著抑制病原尖孢镰刀菌的生长，在盆栽和大田试验中表现出显著的促生和生防效果。在自然环境下特别是根际环境，混合菌群生物膜占主导地位，但实验室条件下的研究主要集中于研究单株菌的行为，关于菌株SQR9与其他微生物在生物膜形成过程中的互作鲜有报道。本研究采用绝对定量PCR对混合菌群生物膜中菌株SQR9进行定量，发现菌体数量比单独培养显著增加，说明可能存在某些微生物能够促进菌株SQR9生物膜的形成。分别提取混合生物膜和剩余培养液的DNA进行16S rDNA扩增并进行高通量测序，发现革兰氏阴性细菌寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp.）在生物膜中的相对丰度显著高于培养液处理，其他微生物类群也存在于生物膜中，但在培养液中的相对丰度要高于生物膜中，我们推测土壤中寡养单胞菌能够与解淀粉芽孢杆菌SQR9互作，参与其生物膜和根际定殖过程。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1黄瓜根际土的分离2
1.2.2黄瓜根际土菌体细胞的提取3
1.2.3生物膜共培养3
1.2.4提取生物膜和培养液中的DNA3
1.2.5定量PCR分析生物膜及游离细胞中菌株SQR9的数量3
1.2.6高通量测序5
2结果与分析5
2.1绝对定量PCR5
2.1.1引物特异性验证5
2.1.2转化子鉴定5
2.1.3标准曲线制作6
2.1.4生物膜及培养液中菌株SQR9的绝对定量6
2.2生物膜基因组高通量测序7
3讨论 8
致谢9
参考文献9
解淀粉芽孢杆菌SQR9根际互作微生物的初步鉴定
引言
引言
黄瓜土传枯萎病是黄瓜种植区主要的连作障害之一，由真菌尖孢镰刀菌黄 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
瓜专化型FOC引起，严重影响黄瓜的产量和品质，研究以微生物防控为核心的综合防控具有重大意义。解淀粉芽孢杆菌SQR9是从黄瓜土传枯萎病发病区的健康植株根际分离的一株根际促生菌（PGPR），能强烈抑制尖孢镰刀菌，在盆栽试验和大田试验中表现出良好的防控黄瓜土传枯萎病和促进黄瓜生长的效果[12]。同时该菌株在实验室条件下表现了优异的生物膜形成、根际定殖、趋化性、可产生多种次生代谢产物（主要为抗生素类物质）等性状，是研究PGPR菌株在根际生态行为及植物微生物互作的优良菌株[35]。
植物根际（根周围大约2mm的区域）组成了一个特殊的土壤生态位，由于根系分泌物的存在，许多土壤微生物被吸引到根际，竞争性定殖于这块土壤绿洲[6]。PGPR在植物根际的有效定殖（形成生物膜）是其发挥促生与生防功能的首要前提[78]。PGPR与植物互惠共生，一方面，PGPR能够为植物根系提供养分并促进根系吸收养分，抵御土传病原菌对植物的侵染，降解正在进入根际和根系的污染物[8]。另一方面，PGPR利用植物根系分泌物作为营养进行大量生长繁殖，并通过自身的代谢对根际土壤和根系产生影响。PGPR只有在根际定殖到一定程度，才能发挥PGPR的群集效益和功能[9]。
尽管自然环境中多菌种的混合型生物膜占主导地位[10]，但在实验室条件下的生物膜研究都还以单菌为主，例如解淀粉芽孢杆菌SQR9自身的生物膜形成机理已有一定研究，但未研究菌株SQR9与根际其他微生物的相互作用，以及这种相互作用对生物膜形成和根际定殖能力的影响。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是PGPR菌的代表菌株，与解淀粉芽孢杆菌SQR9亲缘关系较近，Shank等人发现，枯草芽孢杆菌能够响应土壤中相近种属细菌分泌的物质，如噻唑肽，影响自身生物膜基质基因的表达[1112]。Nandy等人发现，枯草芽孢杆菌与大肠杆菌（Escherichia coli）混合培养时，能产生抗菌物质，裂解大肠杆菌细胞，掠夺营养用于自身生长[13]。芽孢杆菌单独接种木豆时，不能使木豆结瘤，也不能促进生长，而共同接种芽孢杆菌与根瘤菌（Rhizobium）则可以提高木豆的结瘤效率，芽孢杆菌还可以在缺铁条件下产生铁载体，供根瘤菌使用，促进根瘤菌生长[14]。本论文尝试在黄瓜根际筛选出与菌株SQR9互作的微生物，并研究其互作机理，为以后的研究提供材料和理论基础。
1 材料与方法
1．1 材料
供试菌株：解淀粉芽孢杆菌SQR9。
供试作物：黄瓜，品种为津春4号。
供试营养液：1/4 MS营养液：称取1.18 g MS培养基粉末，加双蒸水定容至1 L，用于植物培养。
供试土壤：大兴安岭黑土。
供试培养基：
MSgg培养基：磷酸钾缓冲液5 mM pH 7.0（磷酸氢二钾0.44 g*l1，十二水合磷酸二氢钾0.42 g*l1，丙三醇3 g*l1，谷氨酸5 g*l1），MOPS溶液100 mM pH 7.0，氯化镁2 mM，氯化钙700 μM，氯化铁50 μM，氯化锰50 μM，氯化锌1 μM，硫胺 2 μM，甘油0.5 %，谷氨酸0.5 %，色氨酸50 mg*ml1，苯丙氨酸50 mg*ml1，用于菌体生物膜的培养[15]。
1．2 方法
1．2．1 黄瓜根际土的分离[16]
选取大小一致、颗粒饱满的黄瓜种子，先用无菌水浸泡6 h，然后用2 %次氯酸钠溶液表面消毒2 min，再用75 %乙醇冲洗三次、无菌水冲洗三次，放置在培养皿上，30 ℃静置催芽48 h。胚根露出后，转移至含1/4 MS营养液的50 ml锥形瓶中无菌培养。长至两片真叶期时，挑选萌发较为一致的黄瓜苗移栽至装有2 kg黑土的花盆中（土壤研磨，过10目筛后使用），继续培育。黄瓜土培至四片真叶时期（开花期），将花盆倒置，穿戴已用酒精消毒的手套，小心剥离土壤，用小无菌铲轻拍，使土壤掉落；根表面剩余紧紧附着2 mm左右土壤（视为根际土），用已灭菌的剪刀将根剪下置于灭菌纸巾上；将携带有根际土的根放入30ml PBSS缓冲液（6.33 g NaH2PO4H2O，22 g Na2HPO412H2O，200 μl Silwet L77，双蒸水1升）中；将50 ml离心管盖封好，管口用报纸包上，在摇床中180 rpm，20 min（室温）震荡；过100 μm尼龙细胞过滤器，去除植物根和大块沉积物；滤液置于50 ml灭菌离心管内，在室温下，3200 g下离心15 min，4 ℃暂时保存。

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