珊瑚菜香豆素合成次生代谢途径关键酶基因的克隆与分析【字数：5065】
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 试剂与仪器2
1.1 试剂 2
1.2 仪器 2
2 方法2
2.1 基因克隆2
2.2 生物信息学分析3
3 结果与分析 3
3.1 基因克隆与序列分析3
3.2 蛋白理化分析4
3.3 蛋白二级结构分析7
3.4 蛋白三级结构分析8
3.5 同源性分析10
4 讨论12
致谢12
参考文献12
珊瑚菜香豆素合成次生代谢途径关键酶基因的克隆与分析
学生 黄鑫
引言
北沙参为伞形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq.的干燥根，是一种传统中药材，药用价值高。其味甘、微苦，性微寒，具有养阴清肺，益胃生津的功效。用于治疗肺热燥咳，劳嗽痰血，胃阴不足，热病津伤，咽干口渴[1]等症状。具有一定的耐盐性，自然生长于海边沙滩，也可用肥沃疏松的沙质土进行人工栽培。珊瑚菜含有多种生物活性物质，如香豆素类、黄酮类，聚炔类 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072*
、木质体类、糖苷类[2]等。香豆素是其最重要的生物活性物质之一[3]，也是珊瑚菜的特征性成分，具有镇痛、降压、抗菌、抗肿瘤、抗艾滋病[4、5、6、7、8]等功效。珊瑚菜中香豆素类成分可分为简单香豆素和呋喃香豆素两类，目前从珊瑚菜中分离得到的香豆素类化合物共有15种[9]，多为线性呋喃香豆素。
珊瑚菜香豆素合成代谢途径起始于苯丙氨酸代谢途径，第一步关键酶为肉桂酸4羟基化酶（Cinnamatc4hydroxylase, C4H）[10]，可催化肉桂酸转化为4羟基肉桂酸（对香豆酸），经对香豆酰辅酶A形成伞形酮；伞形酮在异戊烯基转移酶（Prenyltransferase， PT）的催化下发生代谢分支，一支产生去甲基软木花椒素，在补骨脂素合酶[11]（psoralen synthase，PS）作用下合成补骨脂素，进而形成花椒毒酚、花椒素，佛手酚、佛手柑内酯，最终合成异欧前胡素；另一支产生欧前胡素酚，在异补骨脂素酶（Angelicin synthase，AS）作用下合成异补骨脂素，进而形成牛防风素、欧前胡素等化合物。
C4H、PT、PS、AS为珊瑚菜香豆素类化合物合成次生代谢途径中的4种关键酶，本研究在项目组前期已完成的珊瑚菜转录组高通量测序数据基础上，克隆得到4种酶基因完整的cDNA序列，并对其进行初步的生物信息学分析，为探索珊瑚菜香豆素类化合物次生代谢途径奠定基础。
1 试剂与仪器
1．1 试剂
2×T5 Super PCR Mix (PAGE)酶、DL2000DNAMarker、DL5000DNAMarker、DNA凝胶回收试剂盒、pClone007 Blunt Simple Vector Kit试剂盒、Goldenstar™ RT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2试剂盒、质粒回收试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞。
1．2 仪器
普通PCR基因扩增仪、水浴锅、恒温培养箱
2 方法
2．1 基因克隆
根据转录组的高通量测序获得的GIC4H、GIPT、GIPS、GIAS部分基因序列，利用PrimerPremier软件设计特异性引物，上游引物GIC4HF、GIPTF、GIPSF、GIASF，下游引物GIC4HR、GIPTR、GIPSR、GIASR(表1)交由擎科生物有限公司合成。
表1 GIC4H、GIPT、GIPS、GIAS基因扩增所用引物序列
Table1 Primers used for amplification of GIC4H、GIPT、GIPS、GIAS genes
引物
序列5’→3’
GIC4HF
ATGGATTTTCTGTTGTTGGAGAAGG
GIC4HR
TTATAAGGATGTTGGCTTGCAGACG
GIPTF
ATGTCTCAGACATTTATGCGTTC
GIPTR
TCAGCGCATGAAATGAATTAGCA
GIPSF
ATGAAGATGCAGGAACAAAATCCCC
GIPSR
TCAAACATGTGGTGTGGCAACCACC
GIASF
ATGATGGACCAACAATCCTTGTTTC
GIASR
TCAGACACGTGATGTTGCAATCACC
利用实验前期反转录生成的cDNA链作为模板，参照说明书配置反应体系。50μL体系中，取PCR管，向内先加入水32μL, 前后引物各1.5μL, dNTP5μL, Buffer5μL, MgSO43μL, 再加入1μL的模板，最后加入KOD酶，混匀，利用PCR扩增仪大量扩增GIC4H、GIPS、GIAS、GIPT序列。
原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/zyx/607322.html
