野生珊瑚菜的主要分布区是沿海，从珊瑚菜的生长发育环境可以推知，珊瑚菜具有优良的抗盐以及抗旱特性，前期研究已发现一种非特异性磷脂酶C基因（GlNPC1），本研究主要针对该基因进行扩增，构建带有不同标签的蛋白表达载体，通过体外酶促反应检验其对四种不同底物磷脂酰胆碱（PC）,磷脂酰乙醇胺（PE）,磷脂酰甘油（PG）,磷脂酰丝氨酸（PS）的水解效果。结果表明不同标签对该蛋白的纯化以及活性检测均有不同程度的影响，且纯化后目的蛋白His-NPC1的底物倾向性为PC > PG > PE > PS。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1材料 2
1.1.1菌株与表达载体 2
1.1.2试剂与仪器 2
1.2 方法 2
1.2.1获得目标蛋白 2
1.2.2 蛋白活性检测 5
2结果与分析 6
2.1 菌落PCR与测序验证 6
2.2 目标蛋白纯化与表达量检测 7
2.2.1 预实验摸索目标蛋白的表达情况 7
2.2.2 目的蛋白纯化 8
2.2.3 BSA法测蛋白浓度 9
2.3 蛋白活性检测 10
2.3.1 不同标签粗蛋白活性检测 10
2.3.2 HisNPC1和HisNPC4纯化蛋白的底物倾向性 12
3 讨论 12
3.1 不同标签重组蛋白的表达纯化 13
3.2 GlNPC1水解产物可能与珊瑚菜抗盐机理相关 13
致谢 13
参考文献 13
珊瑚菜非特异性磷脂酶C（GlNPC1）蛋白活性分析
引言
珊瑚菜（Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq.）为伞形科珊瑚菜属多年生草本植物，以其干燥根入药，称为北沙参，味甘甜，属滋阴药，具有清肺化痰、养阴润燥、益胃生津的功效。野生珊瑚菜的主要分布区是沿海地区，但是由于近年来人们的过度开采，野生资源越来越少，面临着枯竭的危险，现今市场上的北 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ￥351916072￥ 
沙参多为栽培品，栽培珊瑚菜的主产区是内蒙古地区。从珊瑚菜的生长发育环境可以推知，珊瑚菜具有优良的抗盐以及抗旱特性。
磷脂信号在盐胁迫机制中有重要作用，磷脂酶处于细胞盐胁迫响应过程的上游，在感知受体信号后，通过其产物信号分子，能有效地调控耐盐网络一系列基因的协同表达，能够从细胞、植株水平共同促进植物对盐胁迫的响应。目前珊瑚菜的耐盐机理还未知，在课题组的前期研究中进行了珊瑚菜差异转录组测序，在分析时已经发现了一个非特异性磷脂酶基因，在盐处理后表达量明显升高，暗示其在抗盐中有重要作用，因此将其作为我们的目标研究基因。已知磷脂酶属于一类特殊的水解酶，根据其水解磷脂位点的不同主要分为磷脂酶A1、A2、B、C、D[1]，在植物抗逆机理中至关重要[24]。其中，磷脂酶C（PLC）依水解底物不同分为特异性水解磷脂酰肌醇磷脂酶C（PIPLC）和非特异性磷脂酶C（NPC）[5]。拟南芥中也有发现NPC类磷脂酶基因，在拟南芥NPC家族中，NPC4能显著地被盐诱导激活，NPC4通过产生DAG而间接产生PA；盐处理下，缺少NPC4的突变株（NPC4）呈敏感表型，且其中SOS、ABA相关的基因表达均受到影响[6] 。研究表明，NPC类基因在不同植物中的表达模式不同，分别参与不同生长发育和逆境响应过程[7]。课题组前期研究中已经克隆得到珊瑚菜该非特异性磷脂酶C基因，命名为GlNPC1，以此为研究对象。因此，本研究主要是异源表达并纯化GlNPC1蛋白；比较不同标签对蛋白活性的影响；以及分析目的蛋白GlNPC1的底物倾向性。
材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株与表达载体
大肠杆菌E.coli感受态细胞DH5α以及BL21（购自南京赛泓瑞生物科技有限公司）；表达载体pColdⅠ、PGEX4T1（购自德泰生物科技(南京)有限公司）
1.1.2试剂与仪器
（1）试剂：
Omega质粒提取试剂盒（购自南京赛泓瑞生物科技有限公司）；含有GST标签的蛋白；IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导剂（24 mg/ml，分子量240，稀释后的终浓度为0.3 mmol/L）；蛋白marker；聚丙烯酰胺溶液（30%）； TrisHCl（1.5 mol/ L pH = 8.8）：将Tris溶解于450ml ddH2O中，用2 mol/ L HCl调至pH 8.8，用ddH2O在500ml容量瓶中定容，室温保存； TrisHCl（1.0 mol/ L pH = 6.8）：将Tris溶解于90ml ddH2O中，用2 mol/ L HCl调至pH 6.8，用ddH2O在100 ml容量瓶中定容，于室温下保存； SDS（10%）:将10 g SDS溶解于100 ml ddH2O中，混匀后，于室温下保存；过硫酸铵（10%）:将0.1 g过硫酸铵溶解于1 ml ddH2O中，4℃冰箱保存；电泳Buffer缓冲液(25 mmol Tris,192 mmol甘氨酸，0.1% SDS，pH = 8.3)；蛋白电泳缓冲液；考马斯亮蓝染色液；醋酸甲醇脱色液：（甲醇:水:醋酸=5:5:1）混合备用（以上试剂均由江苏省中国科学院植物研究所药研楼实验室自己配置）；四种底物磷脂酰胆碱（PC）,磷脂酰乙醇胺（PE）,磷脂酰甘油（PG）,磷脂酰丝氨酸（PS）（均购自南京森贝伽生物科技有限公司）；石油醚、乙醚、乙酸、甲苯、氯仿、甲醇、正己烷等化学试剂（均购自南京化学试剂股份有限公司）。
（2）仪器：
分光光度计、离心机（购自上海亚津电子科技有限公司）；超声破碎仪（购自南京以马内利仪器有限公司）；蛋白纯化柱、蛋白超滤管以及蛋白电泳仪（均购自南京金斯瑞公司）；
1.2 方法

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