活血丹为唇形科多年生草本植物，地上部分入药，为常用中药之一；土壤真菌在植物生长和共生过程中起着重要的作用。为了探究活血丹根际土壤真菌种类及其与活血丹植物形态和次生代谢物含量的相关性，本研究收集不同活血丹居群的植物样品和根际土壤，借助高通量测序技术获得不同居群根际土壤的真菌多样性和丰富度，利用HPLC法分析活血丹不同居群内次生代谢物含量，通过统计软件发现，土壤样品中真菌群落的组成及毛壳菌属，被孢霉属及镰刀菌属等对活血丹的次生代谢产物积累有显著影响，被镰刀菌属，蜡壳耳属等对活血丹植物形态有显著影响，研究结果对提高药用植物产量和保障药材品质具有重要意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1标本的采集 2
1.1.1土壤取样2
1.1.2植株采集2
1.2活血丹生次生代谢产物的测定 2
1.3土壤样品的高通量测序与分析 2
1.3.1土壤DNA提取和PCR扩增2
1.3.2高通量测序2
1.3.3统计分析3
2结果与分析3
2.1活血丹植株形态特征及次生代谢物含量分析3
2.1.1活血丹植株形态测定3
2.1.2活血丹次生代谢物含量分析3
2.2高通量测序结果分析 3
2.2.1Alpha多样性分析3
2.2.2土壤真菌群落结构分析5
2.3主要真菌属与活血丹植物形态和次生代谢产物的RDA分析6
3讨论 7
致谢8
参考文献8
图1 活血丹不同居群根际土壤样品真菌群落的稀释曲线4
图2 活血丹不同居群根际土壤样品真菌群落的香农曲线4
图 3 活血丹不同居群根际土壤中主要真菌门的相对丰度(%)5
图 4 活血丹不同居群根际土壤主要真菌属相对丰度(%)5
图 5 活血丹土壤真菌群落与形态指标及次生代谢产物RDA分析6
表1 活血丹不同居群间植物形态比较3
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/> 表2 活血丹不同居群的次生代谢物含量3表3 活血丹不同居群根际土壤样品的真菌群落Alpha多样性分析5表4 根际土壤中主要真菌属对活血丹植物形态和活性成分的影响6活血丹与其根际土壤真菌种类的相关性
引言
活血丹Glechoma longituba (Nakai) Kupr.为唇形科活血丹属植物，干燥地上部分入药，药材名连钱草。味辛、微苦，性微寒，入肝、肾、膀胱经[1]。为中医临床常用中药之一，具有广泛的药理作用，主要表现为利尿利胆、降脂、排石、降血糖、抗炎、抗菌以及对平滑肌的影响等方面[2]，并且近年来研究发现活血丹具有抗HIV的活性、舒张血管等功效[3,4]。据报道，活血丹主要化学成分有黄酮类化合物、熊果酸、齐墩果酸、咖啡酸和迷迭香酸等[5,6]。活血丹野生资源丰富，除西藏、新疆、青海外，全国均有分布[7]。
植物根际是一个特别的微区域，由于受植物根系的影响，使其周围的微区域在物理、化学和生物方面与土壤主体不同，根际微生物在正常条件下比非根际微生物明显多。药用植物根际土壤中存在丰富的细菌、真菌及放线菌，而土壤真菌是最丰富的土壤中的生物有机体，种类繁多，大部分土壤真菌对植物生长发育是有益的，它们对土壤的形成发育、物质循环和肥力演变等均有重大的影响。而药用植物的代谢活动，植株的发育繁殖与其根际真菌的作用密不可分，土壤真菌可以促进药用植物分泌促进植物生长发育的化学物质，易于吸收土壤中的营养物质。同时，一些根际真菌分泌的化合物具有抗干旱、降低水分胁迫、改善土壤结构、供应植物有机营养和调节离子活性的能力，还可以提高药用植物的产量及品质[8]。
此外，菌根是由于真菌侵入植物根系而与植物形成的一种互利共生的联合体。植物和共生菌形成的共生结构可以帮助植物促进植物的生长发育、吸收水分及营养物质、增强植株抗逆性等。对于真菌多样性的分析有两种方法，一种是传统的培养法，第二种是分子生物学方法。土壤真菌相关的分子学研究较少，因为土壤中真菌的复杂多样，但随着PCR扩增技术以及一些测序平台的不断完善使得土壤真菌的相关研究迅速发展，尤其是高通量测序技术的日益成熟为研究土壤真菌DNA的构成提供了大量数据，为直接探究土壤中真菌的群落结构提供了客观而全面的信息[9]。因此，通过高通量测序的手段研究药用植物根际真菌种类、用经典方法分析植物内次生代谢物含量，借助现代数理统计方法分析药用植物根际土壤样品中真菌群落的组成对阐明根际微生物如何提高药用植物产量和品质具有重要的意义。
1 材料与方法
1.1 标本的采集
在实验室前期研究结果基础上，选取南京地区将军山（JJS），紫金山（ZJS），珍珠泉（ZZQ），上峰（SF），栖霞山（QXS）等5个活血丹居群为研究对象，2019年9月于连续两个晴天完成所有植物和土壤样本的采集。
1.1.1 土壤取样
清除地上的垃圾和杂物，小心挖掘活血丹根际周围土壤，轻轻摇动，让易落的土壤从根上掉落，收集仍然附着在根部的土壤作为根际土壤，每个土壤样品至少从5株植物的根际土壤混合获得，以确保重量不低于10 g；储存在干冰中。根际土壤样品送达实验室后，去除杂质后立即在80℃冷冻。
1.1.2 植株采集
供试植物经大学郭巧生教授鉴定为唇形科活血丹属活血丹。收集前，从每个群体中随机选择20株植物测量叶长（LL）、叶宽（LW）、叶柄长（PL）、茎节长（LSN），所有的参数都是在离茎基部第三茎节的叶片上确定的，用于测定活血丹形态特征。
1.2 活血丹生次生代谢产物的测定
将所收集的活血丹植株地上部分在55℃的干燥箱中干燥至恒重，然后筛过100目筛。根据中国药典（国家药典委员会，2015）第四部分的一般原理，采用热浸法测定乙醇溶性提取物的含量。采用氯化铝比色法测定总黄酮（TF）的含量；采用Agilent 1100高效液相色谱仪au3y测定绿原酸（ChA）、咖啡酸（CaA）、迷迭香酸（RA）、齐墩果酸（OA）、熊果酸（UA）的含量[10]。
1.3 土壤样品的高通量测序与分析
1.3.1 土壤DNA提取和PCR扩增
每个样品称取约0.5 g土壤，使用PowerSoil DNA分离试剂盒（MoBio Laboratories, Carlsbad，CA）按照制造商的说明提取土壤DNA；用0.8%琼脂糖凝胶检测基因组DNA的纯度和质量。以土壤 DNA 中真菌的核糖体内转录间隔区（International Transacribed Spacer，ITS）ITS1 (5# CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA3 #)和ITS2 (5 # TGCGTTCTTCATCGATGC3 #)为上下游引物进行 PCR扩增[11]。PCR在德国艾本德PCR扩增仪上进行，PCR反应体系：94℃预变性5 min，94℃ 30s进行28个循环，57℃进行30s，72℃进行60s，最后72℃延伸7 min。

原文链接：http://www.jxszl.com/yxlw/zyx/607319.html