类黄酮化合物是中药化学的一大类代表性次生代谢产物，黄酮类成分木犀草苷是杭菊的指标性成分。本研究拟对杭菊黄酮合成酶基因（FNS II）进行克隆及表达分析，通过提取RNA，反转录成cDNA，设计引物进行基因克隆，在内参基因Actin的对比下再进一步分析不同开花时期的基因表达水平。结果显示FNS II是黄酮积累合成途径中的一个关键酶基因，它在杭菊管状小花和射线小花尚未开放时期表达效果最好，在管状小花和射线小花完全开放时期表达效果较差，其余各个时期的表达量有不同程度的明显差异。该研究可为杭菊中黄酮类成分的生物合成特点提供理论依据。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words: 1
1 材料 2
1.1 样品 2
1.2 仪器与试剂 2
2 方法 2
2.1 FNS II克隆 2
2.1.1 早小洋菊花期不同时期RNA提取 2
2.1.2 总RNA反转录合成cDNA 2
2.1.3 目的基因片段扩增 3
2.1.4 凝胶电泳分析 3
2.1.5 割胶及胶回收 3
2.1.6 载体与目的DNA片段的连接与转化 3
2.1.7 菌液扩增及目的基因测序 3
2.1.8 酶基因表达水平的分析 3
2.2 数据处理与分析 4
3 结果与分析 4
3.1 RNA的提取及反转录的质量 4
3.2 FNS II的PCR扩增结果 5
3.3 FNS II基因生物信息学分析 5
3.4 FNS II表达水平的分析结果 6
4 讨论 8
4.1 影响早小洋菊黄酮次生代谢产物积累的因素 8
4.2 早小洋菊黄酮次生代谢产物的积累与FNS II的关系 8
致谢 8
参考文献 8
杭菊黄酮合成酶基因（FNS II）克隆及表达分析
学生 何昌芬
引言
菊花是我国传统中药材，最常用的解表药之一，是菊科植物菊（Chrys *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ￥351916072$ 
anthemum morifolium Ramat.）的干燥头状花序 ，始载于《神农本草经》。药材按产地、加工方法不同，可分为“杭菊”、“亳菊”、“贡菊”、“怀菊”、“滁菊”五大类[1]，杭菊是其中一大类。杭菊是常用的药食同源药，既可以药用也可以作为茶饮[2]。杭菊主产于浙江桐乡、江苏射阳和湖北麻城三大产区，长于养肝明目，为首选护眼佳品。杭菊目前主要的栽培品种为早小洋菊[3]，该品种性状优良、抗性好、优质、稳产、成熟早，总黄酮含量达3.10%[4]，是本次实验研究的原材料。《中国药典》（2015年版）中明确将木犀草苷、3，5O二咖啡酰基奎宁酸和绿原酸作为杭菊的质控指标，并规定含木犀草苷（C21H20O11）不得少于0.080%，可见黄酮类成分是其重要的活性成分之一，杭菊中黄酮类成分的含量具有良好的开发应用前景，木犀草苷药用杭菊的指标性成分，有着抗癌症、抗心脑脂质过氧化、抗肿瘤、抗诱变、抗菌、抗氧化、改善大脑记忆力[59] 等多样药理活性。木犀草苷在杭菊的生长过程中逐步增加，每年十一月时含量最大[10]。
杭菊在中国有着悠久的栽培种植史，近年来，杭菊的种质资源鉴定和异地引种栽培得到突破，多个地区已经形成杭菊的引种栽培主产区，作为中国的传统中药材和茶饮原材料，国内外科研工作者已对杭菊的形态、颜色等外观特征，栽培种植、良种繁育、新栽培类型、栽培环境及技术等，主含化学成分、有效成分、指标成分，生理作用、药理作用、临床疗效做了系统的研究，但是关于杭菊黄酮合成酶基因克隆及表达分析的研究鲜有报道，因此本课题主要研究目标：研究探索并克隆出早小洋菊中影响黄酮合成积累量的黄酮合成酶关键基因，再进一步分析不同时期的基因表达水平，探索杭菊中黄酮类成分的合成机制；拟解决的关键问题：（1）影响早小洋菊黄酮类成分次生代谢产物合成积累生物合成途径中的关键酶基因的挖掘。（2）对挖掘到的基因进行基因序列分析及不同时期的基因相对表达水平分析，探索杭菊中黄酮类成分的合成机制。
1材料
1.1样品
本实验材料采自于大学药用菊花种质资源圃，经大学中药材研究所汪涛副教授鉴定为杭菊栽培品系中的早小洋菊C. morifolium Zaoyang。采集早小洋菊花期不同时间的头状花序作为实验材料，存放于80℃的冰箱备用。
1.2仪器与试剂
本实验所用仪器有千分之一天平购自于上海良平仪器仪表有限公司；LGJ12 冷冻干燥机购自于北京松源华兴科技发展有限公司；JBQZD16 全温振荡器购自于常州普天仪器制造有限公司；Alpha1506型紫外可见分光光度计购自于美国Alpha公司；ABI StepOne RealTime PCR仪购自于美国ABI公司；PTC200 PCR仪购自于美国Alpha公司；超微量分光光度计购自于杭州奥盛仪器有限公司；RNA提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit）、克隆用反转录试剂盒（PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis）、定量用反转录试剂盒( PrimeScriptM RT reagent Kit with gDNA Eraser)购自于宝生物工程(大连)有限公司；荧光定量试剂盒(2 ×T5 Fast qPCR Mix )购自北京擎科新业生物技术有限公司；寡核苷酸引物购自于生工生物工程(上海)股份有限公司；基因克隆一系列相关试剂盒。
2方法
2.1 FNS II克隆
2.1.1 早小洋菊花期不同时期RNA提取 提取前先将提取所需的相关试剂盒、仪器、试剂管、小钥勺、杵、研钵、自来水等用锡纸包裹后置于高压灭菌锅中121℃进行灭菌处理，灭菌时间为20 min后取出。

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