玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEA）是由镰刀菌属的真菌产生的一种霉菌毒素。ZEA通过多种机制产生直接和间接的毒性作用，包括ROS和脂质过氧化物的上调，降低抗氧化酶活性等。此外，ZEA增加DNA损伤、诱导细胞凋亡并促进炎症反应导致生殖激素紊乱。ZEA对附植后胚胎的毒性损伤已有部分研究成果，但对其早期发育是否具有影响仍然缺乏全面和深入的认识。本试验旨在研究ZEA对早期胚胎发育的毒性损伤，用不同浓度的ZEA处理孤雌激活胚胎，探索ZEA对早期胚胎发育可能的毒性作用机制。本实验设立两个实验组（5μM、10μM）以及对照组，每个处理三个重复。利用免疫荧光染色，通过荧光强度分析检测孤雌激活胚胎内氧化应激状态和自噬水平等指标。结果显示（1）10μM ZEA处理能显著降低胚胎发育的囊胚率和2细胞率，而5μM ZEA处理对2细胞率的影响不显著，这暗示ZEA处理浓度越高，对胚胎早期发育的损伤越大；（2）与对照组相比，ZEA处理后ROS相对荧光强度显著升高（P < 0.01），说明ZEA处理导致早期胚胎发生氧化应激；（3）处理组发现γH2A.X的阳性信号，并且其荧光强度明显高于对照组（P < 0.01），表明ZEA处理导致孤雌激活胚胎内产生DNA损伤；（4）ZEA处理会导致孤雌激活胚胎内发生自噬，ZEA处理组的免疫荧光强度极显著高于对照组（P < 0.01）。综上所述，我们的研究结果表明，ZEA对孤雌激活的早期胚胎具有毒性作用，表现为自噬水平升高、DNA损伤和氧化应激。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 试剂与抗体2
1.2 试剂的配制.........3
1.2.1 猪卵泡液pFF.3
1.2.2 TCM199培养液3
1.2.3 PZM3胚胎培养基3
1.3 猪卵母细胞分离和成熟.3
1.4 体外孤雌激活3
1.5 ZEA处理3
1.6 免疫荧光染色........4
1.6.1 固定与透膜.4
1.6.2 封闭.......4
1.6.3 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: *351916072* 
孵育与清洗.4
1.6.4 核染.......4
1.6.5 制作样本与观察....4
1.7 免疫荧光拍照..........4
1.8 免疫荧光强度分析..4
1.9 指标测定及方法4
1.9.1 氧化应激水平.4
1.9.2 DNA损伤....4
1.9.3 自噬........4
1.10 数据统计与分析..........4
2 结果与分析.5
2.1 确定ZEA最终处理浓度5
2.2 ZEA处理导致孤雌激活胚胎内发生氧化应激.5
2.3 ZEA处理导致孤雌激活胚胎内DNA损伤...6
2.4 ZEA处理导致孤雌激活胚胎内发生自噬.....6
3 讨论........6
3.1 ZEA处理抑制孤雌激活胚胎的早期发育.6
3.2 ZEA处理导致孤雌激活胚胎内发生氧化应激...7
3.3 ZEA处理导致孤雌激活胚胎内DNA损伤...8
3.4 ZEA处理导致孤雌激活胚胎内发生自噬.....8
4 结论 8
致谢 8
参考文献 8
玉米赤霉烯酮对胚胎发育的毒性损伤
引言
霉菌毒素是由真菌产生的有毒的次级代谢产物，在世界范围内广泛侵染粮食作物和饲料，对人类健康和动物的生产机能造成严重的危害。霉菌毒素中毒对畜牧业的发展造成严重威胁，导致巨大经济损失。其中，玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEA）是猪饲料中存在最为广泛，危害最为严重的霉菌毒素之一[1]。玉米赤霉烯酮，1962年Stob等首次从发霉的玉米中分离得到，是由镰刀菌属的真菌，包括禾谷镰刀菌、三线镰刀菌、黄色镰孢、木贼镰孢和尖孢镰刀菌等菌种产生的一种霉菌毒素[2]。ZEA是一种无类固醇结构的2,4二羟基苯甲酸内酯化合物[34]。Elsharkawy和Abulhajj的研究表明ZEA的毒性可能与其内酯环和C4羧基有关[5]。ZEA不溶于水且具有热稳定性，这在很大程度上增加了脱毒的难度。ZEA广泛存在于水分含量大于22%的玉米、大麦、燕麦、小麦、大米和高粱中[6]。
ZEA具有肝毒性和肾毒性，能引发肝和肾组织病变，造成功能损伤[7]；ZEA具有免疫毒性，能影响多个免疫参数，降低免疫球蛋白水平[8]；ZEA具有遗传毒性和细胞毒性，可导致DNA断裂，造成DNA结构损伤，引起DNA复制受阻，抑制蛋白质的合成并干扰细胞分裂周期，从而抑制细胞增殖[9]。ZEA可引起动物急性和慢性中毒，导致动物异常繁殖甚至死亡[10]。ZEA具有类雌激素作用，可广泛侵染粮食和饲料。ZEA主要具有生殖毒性，可导致对生物体生殖系统的不可逆毒性损害，对猪等动物繁殖性能影响严重，引起生殖障碍。ZEA通过雌激素受体介导、破坏血睾屏障、上调氧化应激、诱导细胞凋亡等多种机制产生直接和间接的毒性作用[1114]。ZEA的苯酚环占据17β雌二醇的相同受体区域，因此雌激素受体（ERs）可以与ZEA的苯酚环结合[15]。ZEA发挥雌激素样作用，改变ER的构象形成复合物，并转移进入到细胞核中，与染色质结合调节RNA转录和蛋白质合成。研究发现，睾丸组织中ERα的下调导致细胞凋亡，甚至坏死。相反，ERβ在睾丸中的过度表达导致粗线期精母细胞的凋亡。Adibnia等研究发现经ZEA处理后，精原细胞，精母细胞和精子线粒体含量明显下降，这可能与ZEA和线粒体与ERs的结合有关。结果表明，ERs在mRNA和翻译水平上表达的改变可能是ZEA诱导生殖细胞、睾丸结构和功能受损的原因[16]。此外，ZEA导致多种生殖器官和细胞异常，如小鼠精子形态异常，生精小管萎缩，卵巢异常，雌性生殖器官肥大等[1719]。ZEA主要通过胎盘传播干扰动物胚胎的发育，影响妊娠率和后代卵泡完整性。ZEA可以在妊娠期间通过胎盘转移至胎儿[20]。2014年Fei等发现用20ppm ZEA处理的雌性小鼠降低了怀孕率和产仔数，并降低了F2代的肥力指数[21]。此外，用ZEA处理的亲本显著降低了新生小鼠卵巢中原始卵泡的数量[22]。在妊娠早期，ZEA处理减少了胎儿的重量，并且不同剂量的ZEA阻碍胚胎在子宫内的植入。在高剂量（8mg/kg）ZEA下，蜕膜反应受阻，血浆中孕酮浓度降低，产生由雌激素诱导的多种毒性作用。Schoevers等发现在妊娠和哺乳期摄入被ZEA污染（200, 500和1000μg/ kg）的饲料的猪，卵泡动力学不受影响，但卵泡完整性下降，并且在F1新生儿中伴随着ZEA浓度的升高[23]。
因此，ZEA可能对动物胚胎发育具有更显着的毒性效应。胚胎的早期发育是指由受精卵开始到囊胚的发育阶段，包括2细胞、4细胞、8细胞、桑椹胚、囊胚多个阶段。孤雌激活胚胎是体外研究早期胚胎发育的重要材料。早期胚胎的发育质量是胚胎附植成功的先决条件之一。目前，关于ZEA对胚胎的影响有一些报道，但都集中在附植后的发育阶段，ZEA对早期胚胎的毒性及其机制仍不清楚，本试验的目的是以猪孤雌激活胚胎为模型研究ZEA对早期胚胎发育的毒性损伤及原因，从而在生产中做出有效的预防，并获得关于ZEA对早期胚胎发育的毒性作用，更加全面和深入的认识和揭示其毒性机制，为进一步研究ZEA提供理论基础。

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