双酚A属于环境内分泌干扰物的一种，作用类似于雌激素。研究表明双酚A能够增加鸡胚卵母细胞的数目，对雌性鸡胚的生殖发育有重要影响。本实验旨在探讨双酚A对鸡胚卵巢发育的影响。以注射0.05ug/ml的双酚A为实验组，PBS为对照组，从孵化的E10.5天开始注射，隔一天注射，共注射四次。分别采集E15.5，E18.5，E20.5天的卵巢组织。通过组织切片，进行HE染色，观察双酚 A对鸡胚卵巢形态和减数分裂细胞数目的影响；并通过PCR检测减数分裂相关基因和DNA甲基化转移酶的表达变化。结果表明双酚A处理后，对鸡胚的蛋重胚重并无显著影响，但是对卵巢的发育有重要影响。能够使卵巢变大，卵巢组织更加疏松。增大卵巢皮质区的厚度，显著增加进入减数分裂的细胞数目。双酚A能够上调Stra8，Scp3，Dmc1和Spol1 基因的表达，显著增加E15.5和E18.5天时Stra8和Spol1基因的表达，E18.5天时Dmc1基因的表达和E20.5天时Scp3基因的表达。同时双酚A还能抑制DNA甲基化转移酶的表达，从而起到间接抑制DNA甲基化的维持。综上所述，双酚A能够促进鸡胚胎期卵巢的发育。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言1
1 材料方法2
1.1 实验材料及样品采集2
1.2 主要试剂3
1.3 主要仪器3
1.4 主要溶液及其配制方法3
1.5 指标测定3
2 结果与分析5
2．1 双酚A对鸡蛋重、胚重和胚蛋比的影响 5
2．2 卵巢组织形态的观察 5
2．2．1 卵巢组织外部形态的观察5
2．2．2 卵巢组织减数分裂细胞数目的观察6
2．3 双酚A对雌性生殖细胞减数分裂相关基因表达的影响 6
2．4 双酚A对雌性生殖细胞DNA甲基化转移酶的影响 7
3 讨论8
3．1 家禽的早期胚胎发育过程 8
3．2 双酚A与DNA甲基化转移酶 8
3．3 双酚A与鸡胚减数分裂 9
致谢9
参考文献9
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酚A对鸡胚胎期卵巢发育的影响
引言
引言
双酚A属于环境内分泌干扰物的一种，在日常生活中普遍存在，如水体和沉积物中,矿泉水瓶，食品包装内里，刷牙填充剂等[1],是人类生活能够普遍接触到的一种物质。双酚A 与雌二醇（E2）和己烯雌酚（DES）的结构非常相似[2]，所以也具有弱雌激素的活性，双酚A能够进入机体内，干扰机体的内分泌系统，进而影响动物的生殖发育。双酚A作为类雌激素，发挥作用的方式和途径和雌激素相似，主要是和靶细胞上的雌激素受体结合来发挥作用，同时还可以干扰机体内雌激素的合成[3]，进而调控着核内基因的转录过程。双酚A还可以调节促黄体素和孕酮的含量，并影响腺苷酸环化酶过程调节香化酶的表达，最终可以提高雌激素在体内的含量[45]。据以往研究表明，低剂量的双酚A会对雌性生殖功能造成破坏。高剂量的双酚A，会使体内的下丘脑垂体性腺轴的功能发生异常，出现早熟，胎儿减数分裂过程异常的现象［6］。在雌性小鼠灌注低剂量的双酚A实验中，发现小鼠在性发育启动前，下丘脑垂体性腺轴已经提前被激活，说明雌性小鼠暴露于双酚A中能够明显促进中枢性性早熟［7］。双酚A具有剂量小但危害大的特点，一直以来都是人们研究的热点，目前对双酚A的研究热点主要集中在如何降解它，减少其在生活中的暴露，但作为类雌激素的一种，如何将双酚A用于生产中，提高作为类雌激素发挥促进发育生殖的研究较少。但双酚A对鸡胚卵巢发育的具体影响，是否能够促进鸡胚减数分裂的进程，提高家禽产蛋率，需要通过具体实验去验证和探讨。
DNA甲基化属于DNA化学修饰的一种形式，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。一些研究表明，在小鼠孕期接触到双酚A，会影响胎儿生殖细胞甲基化和基因印迹的改变［8］。因此双酚A可以在胚胎发育初期诱导DNA甲基化的改变［9］，并且这种现象可以遗传。据了解，双酚A能够降级鸡胚的总DNA甲基化的表达量，从而促进相关基因的表达，这对于提高家禽遗传性能的表达具有重要理论意义［10］。
不同年龄的动物暴露于不同浓度的双酚A，都会对卵巢发育产生不同程度的影响［2］，都会影响卵巢中卵母细胞的发育，干扰卵巢减数分裂进程，程度或轻或重。有实验证明：双酚A会对卵巢卵母细胞的第一次减数分裂前期造成影响，使得染色体交换和错配比例升高，造成分离异常，使得卵母细胞的存活率降低。Hunt 等［11］研究员对此结论进行验证，对四月龄的恒河猴胚胎暴露于双酚A中，发现双酚A的确会使第一次减数分裂前期细胞染色体分离异常。Brie oEnríquez 等［12］人发现1μmol/L的双酚A会造成卵泡闭锁等严重现象，相较于正常发育情况，暴露于双酚A的卵巢卵母细胞的闭锁退化率提高了五倍，严重降低了它的存活率。对卵巢发育产生显著性影响。
双酚A对减数分裂的影响大多集中于哺乳动物，但家禽的早期胚胎发育明显与哺乳动物有很大的不同。鸡胚发育早期接触到双酚A，对卵巢发育和卵泡形成与哺乳动物的影响也显著不同。有实验研究表明，低剂量的双酚A能够促进卵巢原始卵泡的数量，同时相较于正常自然生长情况下，能够促进相同胚龄进入减数分裂细胞的数量，促进与减数分裂有关基因的表达，使得早期胚胎提前进入减数分裂进程，从而促进鸡胚卵巢的发育。本实验主要通过对比实验进行展开研究，注射0.05ug/ml的双酚A作为实验组，与注射PBS的对照组进行比较，采集孵化阶段15.5天，18.5天以及20.5天的卵巢组织进行实验。分别制作石蜡切片，甲基化转移酶表达量的观察以及减数分裂相关基因的表达变化观察。实验过程中通过HE染色观察进入减数分裂细胞的数目情况，同时通过甲基化转移酶和减数分裂前相关基因表达的变化，共同来判断双酚A对鸡胚胎期卵巢发育的影响，从而完成整个实验的研究内容。
1 材料方法
1.1 试验材料及样品采集
实验材料为鸡蛋，在旋转孵化箱内进行孵化。在E10.5天时，2/3（80枚）的鸡蛋注射0.05ug/mL的BPA 作为处理组，1/3（60枚）的鸡蛋注射PBS溶液作为对照组。隔一天进行注射。孵化至E15.5，E18.5，E20.5三个时期采集鸡胚性腺组织，用作切片，定量和半定量等实验材料。
1.2 主要试剂
BPA、PBS、甲醛固定液、二甲苯、酒精梯度、伊红、苏木精、DEPC等。
1.3 主要仪器
旋转孵化箱、显微镜、PCR管、离心机、电泳仪、超低温冰箱、石蜡切片机等。
1.4 主要溶液及其配制方法
1.4.1 双酚A配制 称量20 mg，溶于1 ml的DMSO中，配成20 mg/ ml的BPA储液。然后加入PBS溶液，逐步稀释到0.05 ug/ml。

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