氧分压对猪卵母细胞及早期胚胎发育的影响
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验材料 2
1.1.1猪卵巢的采集2
1.1.2主要试剂2
1.2卵母细胞的提取2
1.3体外成熟与孤雌激活2
1.3.1体外成熟2
1.3.2孤雌激活与体外培养3
1.4荧光染色与计数3
1.5差异染色3
1.5.1漂洗与通透3
1.5.2 PI/Hochest 33342染色3
1.5.3压片与拍摄3
1.6试验设计3
2 结果与分析 3
3讨论4
致谢5
参考文献6
表12
表23
图14
图24
图34
氧分压对猪卵母细胞及早期胚胎发育的影响
引言
引言
2005年，国内第一头体细胞克隆猪终于在中国农业大学顺利降生，这一成果在世界范围内使中国成为了七个拥有完全自主克隆猪能力的国家之一，并且填补了中国在克隆猪领域的空白。可是目前因为所获的囊胚质量差，细胞异常调往等原因，导致克隆猪的效率一直不高，其中一个非常重要的影响因素就是卵母细胞及胚胎的培养环境[1]。现在，基础的体外培养仍然是采用的传统细胞培养技术，因此很难提供一个如体内一般的理化环境给卵母细胞与胚胎[2]。所以，这些因素促使国内外的研究员改善了了培养环境的成分和结构从而提高体外培养的卵母细胞和胚胎的成熟与发育潜力[3]。 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072^
除了改进培养液中的组成成分，培养环境中的氧气和二氧化碳的含量也进入了研究员的视野当中。经研究得知，在猪的输卵管和子宫内所检测到的氧含量在百分之五左右[4]，而空气中氧气则是百分之二十左右，所以在体外培养中，降低培养环境中氧分压以模拟卵母细胞和胚胎在体内培养环境的成熟与发育理论上可以促进体外培养甚至克隆的成功率。因此，本论文就两种不同的氧分压的体外培养中，猪卵母细胞及早期胚胎的发育潜能展开了试验。
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 猪卵巢的采集 从屠宰场得到母猪的卵巢后，将卵巢放入含盘尼西林与硫酸链霉素的生理盐水，在30℃～35℃下四个小时内运回开展实验。所采集卵巢的猪的年龄、品系、家族背景不详。
1．1．2 主要试剂 所用试剂及药品情况见表11，本实验里所用的药品除特别说明其余全部来自Sigma公司。
序号
名称
生产厂家
1
FBS
Hyclone 公司
2
PMSG
Hyclone 公司
3
hCG
Hyclone 公司
4
FSH
Hyclone 公司
5
PBS
Hyclone 公司
6
洗卵液
自配（添加10%NBS的PBS）
7
pFF（猪卵泡液)
自配（常规制备法）
8
IVM
自配(50mL)：39mL Medium 199 + LGlutaMAX 500μL + 5mL PFF + 5mL Serum + 15U/mL PMSG + 15U/mL HCG + 121μL Gentamicin
9
PZM3
自配(50mL)：0.3156g NaCl +0.1053g NaHCO3 + 0.0373g KCl + 0.0308g CaLactate•H2O + 0.0250g MyoInositol + 45.0000g Sigma H2O + 0.5000g NEAA100X + 1.0000g EAA50X + 0.0073g LGlutamine + 0.0020g Gentamicin + 0.0240g/10mL KH2PO4 + 0.0240g/10mL MgSO4 + 0.0220g/10mL Napyyate + 0.0100g/1mL PHCNOL REd(Stock 10mg/ML)
10
PCC
自配(P3:CHX:CB=1000:10:5)
表1主要试剂
1．2 卵母细胞的提取
用抽吸法采集卵巢卵母细胞。将所得到的卵巢清洗三遍后，用带有12#针头的10mL注射器抽取卵巢上卵泡的卵泡液，并将其汇聚到一起，沉淀10分钟，取其沉淀用IVM稀释，之后在体视显微镜下，利用口吸管分捡出卵母细胞，剔除胞质不匀称的卵母细胞与各种畸型的卵母细胞、裸卵或半裸卵。用洗卵液及成熟培养液各自清洗三遍后，在IVM培养液中进行体外成熟培养，采卵全程在35℃下进行
1．3 体外成熟与孤雌激活
1．3．1 体外成熟 将要培养的卵母细胞分为A组与B组，培养环境分别为39℃、5%CO2、饱和湿度、5%O2和39℃、5%CO2、饱和湿度、20%O2。培养四十四小时后，在37℃下，先用石蜡油封盖，再用0.3%HY酶（透明质酸酶溶液加无Ca2+、Mg2+的PBS自配）去除卵母细胞周围的颗粒细胞，用移液枪反复吹打100次，并通过显微镜观察其成效，直到颗粒细胞被全部消化，将得到的裸卵放入T2溶液中清洗三次，洗去残留的HY酶，之后提取已经排出第一极体的卵母细胞，后进行孤雌激活。
1．3．2 孤雌激活与体外培养 用F+溶液（激活液）清洗三遍挑选出的排出极体的卵母细胞后，用口吸管将细胞移到电极宽度为0.5mm的电击槽里，电击槽事先浸满F+溶液（激活液），电刺激后（电激活参数为：1.2kV/cm、脉宽100μs的3次直流刺激，）[5]将卵母细胞用培养液清洗三次，移进PCC溶液（化学激活液）里，放入培养箱中培养4小时（化学激活），后转入到PZM3培养液中培养。当天记为第零天，第二天（48小时）测定卵裂数，第六天（144小时）测定囊胚数。
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