疫霉菌隶属茸鞭生物界卵菌门，其致病机制与真菌有显著差别，从分子水平上研究疫霉的致病机制是控制疫霉病害的重要理论基础。疫霉菌能够侵染寄主植物的不同器官。转录因子为基因表达调控中极为重要的部分，参与病原菌的生长发育以及侵染致病过程。本研究选取大豆疫霉根部侵染特异的转录因子PsBZPc17，设计sgRNA以及同源重组载体，通过PEG介导的原生质体转化，对进行其进行CRISPR/Cas9敲除，最终对转化子的生长速率、游动孢子产量、卵孢子产量以及致病性进行检测观察。研究发现PsBZPc17对大豆疫霉的无性生殖有显著影响，将来可能作为针对大豆疫霉产孢农药的药物靶标。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1供试菌株 2
1.2培养基配置3
1.3载体构建3
1.3.1sgRNA表达载体3
1.3.2同源重组载体构建4
1.4大豆疫霉原生质体转化4
1.4.1大豆疫霉培养4
1.4.2制备原生质体4
1.4.3原生质体转化5
1.5转化子筛选5
1.5.1提取转化子基因组DNA5
1.5.2通过 PCR 和基因组测序来验证目的基因的敲除6
1.6PsBZPc17敲除突变体表型分析6
1.6.1生长速率的测定6
1.6.2游动孢子计数6
1.6.3卵孢子计数6
1.7致病性测定7
2结果与分析7
2.1 PsBZPc17表达模式分析7
2.2 获得PsBZPc17 敲除突变体8
2.3 PsBZPc17突变体生长情况8
2.4 PsBZPc17突变体游动孢子产量9
2.5 PsBZPc17卵孢子突变体产量9
2.6 PsBZPc17突变体致病性10
2.6.1黄化苗接种法10
2.6.2离体叶片接种法10
3讨论 11
致谢12
参考文 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: #351916072# 
献12大豆疫霉根部侵染特异表达转录因子PsBZPc17的功能研究
引言
疫霉菌作为一类植物病原体，广泛感染农作物、蔬菜和树木等，引起多种植物的毁灭性病害，对世界农业生产和自然生态带来严重损失[1]。例如大豆疫霉（Phytophthora sojae）引起的土传病害，在大豆整个生育期中均能够侵染大豆引起其根腐病，为大豆生产上毁灭性的病害之一。大豆疫霉属于卵菌，在形态学和生理学上类似于丝状真菌，但在进化上归于包含硅藻属和褐藻属的茸鞭生物界[2]，与真菌的遗传距离相距甚远。进化上的区别使得疫霉可能拥有一套与其他真菌不同的致病机制[3]，因而在多数生化途径、侵染机制等方面与真菌有显著差别，导致传统的杀菌剂无法有效用于疫霉病的防治。从分子水平上研究疫霉的致病机制从而寻找有效的防治措施，对控制大豆疫霉病害意义重大。
卵菌属于二倍体，其自身发生同源重组的概率极低，传统的同源重组介导的基因敲除分子遗传操作技术无法在卵菌中很好的运用。1991年Judelson等人在致病疫霉中建立了用聚乙二醇/氯化钙（PEG/CaCl2）介导的原生质体转化技术[4]。再到1998年时，Kamoun等人通过Ham34启动子连接INF1基因反向片段的载体，在致病疫霉中实现了基因沉默[5]。一直以来在疫霉菌定向突变和基因替换领域上技术的限制使得疫霉的致病基因研究得不到显著的突破，2015年，Tyler教授研究组建立的CRISPR/Cas9系统则很好的弥补了在卵菌领域基因组研究上的技术空白[6]。
在疫霉的侵染过程中，基因表达调控至关重要。近几年，大豆疫霉全基因组测序已经完成，Ye等也已经对大豆疫霉生长发育和侵染过程的十个阶段进行了转录组分析，发现大豆疫霉基因组的转录在生长发育和致病过程中会发生强烈的动态变化以适应特定阶段的生理需要[7]。转录因子可以与顺式作用元件中的转录因子结合位点特异性结合来调控基因转录，能够保证目的基因以特定的强度在特定时间特定空间表达，在基因表达调控网络中起到关键作用。转录因子调控的生理生化过程也极为广泛，在生物体的整个生活史中都有十分重要的作用。在卵菌方面，对其致病分子机制的研究主要围绕效应分子在植物与病原菌互作中的作用而进行，而在转录因子对致病机理方向上的研究则较少。
bZIP（Basic Leucine Zipper）家族转录因子是真核生物中数量最庞大、最具序列多样性的转录因子家族之一。bZIP转录因子可根据其保守的DNA结合域而被鉴定到，该功能域含有一个富含碱性氨基酸区域和一个亮氨酸拉链结构区域，分别负责与特异性DNA序列的结合和形成二聚体。bZIP转录因子参与生物体众多重要的生命活动过程[8]。疫霉中的转录调控机制与真菌有较大差异。大豆疫霉Ye等在研究中发现在大豆疫霉的基因组中编码了许多新型的bZIP转录因子，在这些bZIP转录因子中发现其DNA结构中的保守氨基酸位点有一些变化[7]。对卵菌启动子的分析中发现卵菌基因组中含有许多卵菌特有的启动子元件，并未发现高等生物启动子中普遍存在的TATA box元件[9]。进一步表明卵菌可能具有独特的调控网络，而这些bZIP转录因子可能调控一些独特的生理过程。
实验室前期研究发现大豆疫霉基因组中编码了大量具有特殊DNA结合域的bZIP转录因子，其转录因子主要在孢子囊、游动孢子、休止孢和侵染阶段发生转录变化，且多个转录因子在外源过氧化氢处理下被诱导表达，说明这些bZIP可能参与致病过程的调控。前期实验室对大豆疫霉侵染根部和叶部的转录组进行分析，分别鉴定到了320个在根部侵染时特异上调表达的基因及322个在叶部侵染时特异上调表达的基因。其中3个转录因子为根部侵染特异基因，2个转录因子为叶部侵染特异基因。对其中差异表达倍数最大的基因PsBZPc29进行敲除，突变体对根部侵染能力下降，对叶部侵染能力没有显著变化。说明了根部侵染特异的转录因子可能参与了根部特异的转录调控过程中。
为了进一步对不同器官侵染特异的转录调控过程进行研究，本实验选取另一个根部侵染特异的转录因子PsBZPc17，分别设计sgRNA和同源重组载体，通过PEG介导的原生质体转化，对进行其进行CRISPR/Cas9敲除，获得转化子T18、T50，最终对转化子的生长速率、孢子囊产量、卵孢子产量以及致病性进行检测。
1 材料与方法
1．1 供试菌株
大豆疫霉(P. sojae)全基因组测序的野生型菌株P6497由BrettM.Tyler 教授（美国俄勒冈州立大学）馈赠，于大学卵菌与真菌分子生物学实验室保存。

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/67323.html