麦芽糖淀粉酶能够水解淀粉产生高纯度的麦芽糖，在食品、饲料、药物、生物医学等领域展现出广阔的应用前景。本实验构建粘细菌麦芽糖淀粉酶CoMA的MBP-Tag（麦芽糖结合蛋白标签）融合表达以及密码子优化表达系统，以期获得大量目的蛋白。通过PCR扩增CoMA基因，连接至pMAL-c5X表达载体并转化至E. coli BL21，实现了在大肠杆菌中的高效异源表达。CoMA-MBP融合蛋白经亲和层析纯化后获得的蛋白量为40.2 mg/L培养基，比酶活为77.3 U/mg。CoMA基因经密码子优化后在大肠杆菌中表达为包涵体，经复性纯化后的蛋白量为70.5 mg/L培养基，比酶活为28.7 U/mg。采用商业化结晶试剂盒初步筛选CoMA的结晶条件，为CoMA的晶体结构研究提供了基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 实验材料 2
1．1．1 菌种与质粒 2
1．1．2 培养基与常用试剂 2
1．1．3 酶及试剂 3
1．1．4 仪器与设备 3
1．2 实验方法 3
1．2．1 pET29aCoMA质粒的提取 3
1．2．2 PCR扩增目的基因CoMA 3
1．2．3 目的DNA的回收纯化 4
1．2．4 pMALc5XCoMA表达载体的构建 4
1．2．5 感受态细胞的制备 5
1．2．6 转化及转化子验证 5
1．2．7 重组CoMAMBP融合蛋白的诱导表达 5
1．2．8 镍柱亲和层析 6
1．2．9 透析与超滤 6
1．2．10 CoMA的密码子优化及表达 6
1．2．11 CoMA包涵体的纯化 6
1．2．12 蛋白质含量测定 7
1．2．13 酶活力测定 7
1．2．14 结晶条件的筛选 7
2 结果与分析 7
2．1 MBPTag融合表达菌株的构建 7 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: #351916072# 

2．1．1 CoMA基因的PCR扩增及胶回收产物 7
2．1．2 重组表达载体pMALc5XcoMA的构建 8
2．2 重组CoMAMBP融合蛋白的表达与纯化 8
2．3 CoMA的密码子优化表达 9
2．4 CoMA包涵体的纯化 9
2．5 蛋白质含量测定标准曲线 11
2．6 酶活测定标准曲线 11
2．7 蛋白质含量及酶活对比 11
2．8 蛋白质结晶条件的筛选 12
3 讨论 12
致谢 13
参考文献： 13
麦芽糖淀粉酶CoMA的表达、纯化与结晶
引言
引言：淀粉是自然界中数量分布仅次于纤维素的一类多糖，能够为不同的生命体提供能量，同时其水解产物还被广泛的应用于人类生活的各个方面。麦芽糖浆是以精制淀粉为原料制成的淀粉糖浆，经酶制剂液化和糖化，再精制浓缩而成，其最主要的成分为麦芽糖（即麦芽二糖，含量≥50%），其他成分包括葡萄糖、麦芽三糖、麦芽四糖及四糖以上的葡聚糖等，在各领域均有广泛的应用，如在食品行业可作为填充剂和营养甜味剂，在医药工业可配制各种中成药、止咳糖浆等 [1]。
产麦芽糖α淀粉酶是一类α淀粉酶，其可通过水解淀粉及相关多聚糖产生主要产物麦芽糖，该酶包括麦芽糖淀粉酶(EC3.2.1.133，maltogenic amylase)、环状麦芽糊精淀粉酶(cyelomaltodextrinase，EC3.2.1.54)以及新普鲁兰酶(EC3.2.1.135，neopullulanase) [2]。产麦芽糖α淀粉酶广泛分布于GH13家族，大多数为胞外酶且具备多底物特性以及底物优先选择性，其可通过水解α1,4、α1,6葡萄糖苷键作用于淀粉及环状糊精、普鲁兰多糖等相关多聚糖、寡糖产生主要产物为α麦芽糖[2]。其中麦芽糖淀粉酶作为一种新型的酶制剂，最适底物为环糊精，可水解环糊精和淀粉产生麦芽糖，同时也能水解普鲁兰多糖产生潘糖[3]，一些来源的麦芽糖淀粉酶还具有转糖基作用[4]。
目前研究的麦芽糖淀粉酶主要源自于微生物，包括Thermomonosporaceae，Bacillaceae等细菌，Aspergillus，Penicillium等真菌，以及Hyperthermophilic archaeon等极端微生物[5,6]。不同麦芽糖淀粉酶在酶学特性以及产麦芽糖能力等方面有较大的区别。来源于Sreptomyces praecox NA273的高产麦芽糖淀粉酶的最适pH为6.0，最适反应温度47℃，以可溶性淀粉为底物的比活力为1643 U/mg，水解产物中麦芽糖得率高达80%，且产物中无葡萄糖[7]。Collins等人纯化得到的麦芽糖淀粉酶，以可溶性淀粉为底物的比活力为5400 U/mg，最适pH为6.0，最适温度为65℃，麦芽糖含量高达73%，水解过程中不产生葡萄糖，但有大量麦芽三糖残留[8]。来自于Bacillus，Aspergillus等的麦芽糖淀粉酶的应用化程度较高，如Bacillus stearothermophilus来源的热稳定性麦芽糖生成酶BStA被制备成酶制剂，作为保鲜剂用于淀粉及烘焙工业[9,10]，Aspergillus oryzae来源的真菌α淀粉酶Fungamyl (Novo Industry)也已被商业化应用，所产糖浆麦芽糖含量为4060%[11,12]。
麦芽糖淀粉酶具有三个典型的特征：(1)通过水解反应作用于α型糖苷键产生α异头物的单糖或者低聚糖，(2)具有包含催化位点的(β/α)8或者TIM桶状结构，(3)一级结构包含四个高度保守区域β2XDX、β4RXD、β5XEX、β7XHDX，其中一些氨基酸对蛋白催化活性以及结构稳定性具有重要作用[13]。蛋白结构分析表明麦芽糖淀粉酶的C端结构域与(β/α)8或者TIM桶状结构高度保守，而N端结构域存在差别。N端区域关键氨基酸对于蛋白底物亲和力具有重要的作用[14,15]，并且一些关键氨基酸对蛋白稳定性的影响也有相关报道[16]。
基于蛋白结构特性的差别，麦芽糖淀粉酶在水解反应过程显示出不同酶学特性和底物催化机制。目前已报道的麦芽糖淀粉酶的催化机制分为单分子催化反应和多分子催化反应两个类别[17]，但副产物较高，限制了其进一步的应用，因此发掘性能优良的麦芽糖淀粉酶在淀粉处理和产物应用等方面具有极高的研究意义。本实验以麦芽糖淀粉酶CoMA为研究对象，该酶是实验室前期从Corallococcus sp. EGB中克隆鉴定的一个GH13家族的淀粉水解酶，对α1,4糖苷键有水解活性和转糖基活性，并能够通过转糖基作用产生高纯度的麦芽糖，且产物中不含葡萄糖等副产物。鉴于CoMA特殊的催化特性，拟通过蛋白质结构解析该酶的催化机制，但前期构建的大肠杆菌表达系统的蛋白表达量极低，导致无法开展蛋白纯化及结晶实验。故本实验尝试通过MBP融合表达及密码子优化等策略构建大肠杆菌表达系统，以期诱导产生可溶性重组蛋白从而进行结构解析，为该酶的催化机制研究提供基础。

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