目录
摘要1
关键词1
Abstract2
Key words2
引言3
1材料与方法6
1.1试剂6
1.2培养基 6
1.3常用试剂和缓冲液6
1.4菌株、质粒和引物6
1.5龙胆酸双加氧酶基因orf04697表达载体的构建 7
1.5.1龙胆酸双加氧酶基因orf04697的特异性扩增 8
1.5.2质粒pET29a(+)的提取 8
1.5.3质粒pET29a(+)的双酶切反应 9
1.5.4表达载体pETorf04697的构建 10
1.6重组菌株的诱导表达10
1.7目的蛋白的纯化11
1.8 SDSPAGE及丙烯酰胺凝胶电泳11
1.9 目标蛋白透析11
1.10 GDO体外降解功能检测12
1.11温度对GDO酶活力影响12
1.12 GDO的酶动力学常数测定12
2结果与分析13
2.1 GDO的异源表达与纯化13
2.1.1龙胆酸双加氧酶基因orf04697的特异性扩增与表达载体的构建13
2.1.2 GDO的表达与纯化13
2.2 GDO酶活的功能鉴定14
2.3温度对GDO酶活力的影响15
2.4 GDO的酶动力学常数测定15
3 讨论16
致谢17
参考文献18
附录一 培养基及试剂配方20
附录二 切胶回收DNA片段操作步骤21
西维因降解菌Rhizobium radiobacter X9中龙胆酸双加氧酶基因的克隆和表达
摘 要
西维因，又叫1萘基N甲基氨基甲酸酯，它主要是用于防治农林害虫，是一种典型的氨基甲酸酯类的杀虫剂。然而，由于西维因对靶标生物也具有较大的毒性，近些年，西维因的残留带来的环境问题和生态问题也日益引起人们的关注。根瘤菌Rhizobium radiobacter X9为本实验室前期工作中分离、保存 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ￥351916072￥ 
的西维因降解菌，该菌株具有完整的西维因降解途径，其中龙胆酸双加氧酶催化其西维因下游代谢途径的起始反应。通过基因组比对和分析，初步推测到一个龙胆酸双加氧酶的编码基因orf04697。本实验通过对龙胆酸双加氧酶基因的异源表达、蛋白纯化，得到龙胆酸双加氧酶的纯酶，并研究其酶学特性和酶动力学参数，为西维因下游代谢途径的研究奠定基础。实验数据得出，30℃为龙胆酸双加氧酶的最适温度，2030℃时，酶活保持在75%以上，3080°C时，酶活随着温度的升高而逐渐降低，80°C时，几乎完全丧失酶活。在酶动力学常数测定实验中，计算得出Vmax数值为（3.96±0.09）×102 μmol s1mg1, Km数值为28.09±2.44 μM, Kcat数值为1.64±0.038 s1, Kcat/Km数值为（5.90±0.64）×102 s1μM1。
引言
1.LB培养基（g/L）
酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g.
2.基础盐(MSM)培养基（g/L）
硝酸铵1.0 g，磷酸二氢钾0.5 g，磷酸氢二钾1.5 g，氯化钠1.0 g，七水合硫酸镁0.2 g加去离子水搅拌完全溶解
二、常用试剂和缓冲液
1.核酸电泳缓冲液(50×TAE，1 L)
准确量取57.1 mL冰醋酸，50 mL 1 M EDTA (pH 8.0)，称取242 g Tris base放入量筒中，加入去离子水定容到1 L。工作时需要将母液浓度稀释50倍，成为1×TAE
2. 1 M TrisHCl (pH 7.5)
准确称取121.1 g Tris，加入0.8 L蒸馏水置于量筒中充分搅拌溶解，加浓盐酸，边家边用pH试纸测量pH值直至溶液pH为7.5，用蒸馏水定容至1 L，室温保存。工作时需将1 M TrisHCl稀释至20 mM。
3.考马斯亮蓝R250染液
精确称取1.0 g考马斯亮蓝R250于烧杯中，加入0.1 L冰醋酸、0.25 L 异丙醇、0.65 L去离子水，充分搅拌混合。
4.考马斯亮蓝染色脱色液
每1 L考马斯亮蓝染色脱色液中按照乙醇:醋酸:和去离子水=1:5:17的比例配置，充分搅拌混合。
5. 10% SDS
每1 L液体中含有SDS 100 g，按此比例配置后，放入68°C水浴中溶解，ddH2O定容到100 mL
附录二 切胶回收DNA片段操作步骤
1.电泳结束后，戴手套操作将凝胶转移到紫外灯下，切胶时关闭紫外灯，用小刀将目标片段切下，尽可能少切下其他部分；
2.切下的凝胶转移到一个新的1.5 mL离心管中，做好标记，确定凝胶的大致体积，按比例加入DNA Binding Buffer，放入55°C条件下5 min使凝胶融化，期间观察凝胶的融化情况，不易放在55°C下过长时间；

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