灵芝(Ganoderma lucidum)是一种重要的药用真菌，其产生的灵芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharide，GLP)是一种复杂的大分子生物活性物质，具有极其重要的药理作用。为了探究血红素单加氧酶基因沉默对灵芝多糖生物合成的影响，以血红素单加氧酶沉默作为单一变量，以正常质粒转化作为对照组，采用苯酚硫酸法，测定灵芝菌株的生物量，胞内多糖和胞外多糖含量。同时，研究以18S rRNA为内参基因，通过实时荧光定量PCR的方法，测定了灵芝多糖合成相关酶基因的转录表达水平。结果显示，血红素单加氧酶基因沉默降低了灵芝菌株的生物量，影响了灵芝菌株的物质积累，但是，显著提高了灵芝胞外多糖的含量。实时荧光定量PCR结果显示，血红素单加氧酶基因沉默可以有效提高灵芝多糖合成相关酶，磷酸葡萄糖异构酶(PGI)、磷酸葡萄糖变位酶(PGM)、磷酸甘露糖异构酶(PMI)和葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)的转录表达水平，其中磷酸葡萄糖异构酶的表达水平提高极其显著。表明血红素单加氧酶基因沉默影响了灵芝多糖合成相关酶基因的表达，从而影响了灵芝多糖的合成。
目录
摘要 3
关键词 3
ABSTRACT. 3
KEY WORDS 4
引言 4
1 材料与方法 5
1.1 材料 5
1.2 方法 5
1.2.1 灵芝胞外多糖的提取 5
1.2.2 灵芝胞内多糖的提取 5
1.2.3 苯酚硫酸法测定多糖含量 6
1.2.4 菌丝体的收集 6
1.2.5总RNA的提取 6
1.2.6 cDNA的制备 7
1.3 实时荧光定量PCR的检测 7
1.3.1 实时荧光定量PCR引物设计和引物特异性的验证 7
1.3.2 实时荧光定量PCR扩增体系和程序设定 7
1.3.3 实时荧光定量PCR的数据处理 8
2 结果与分析 8
2.1 葡萄糖标准曲线的制作 8
2.2 血红度单加氧酶沉默对灵芝生物量、灵芝多糖产量影响 9
2.3 血红素单加氧酶沉默对灵芝多糖生物合成过程中相关 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ￥351916072$ 
酶基因表达量的影响 10
3 讨论 11
致谢 12
参考文献 13
血红素单加氧酶基因沉默对灵芝多糖生物合成的影响
生物学基地班 张慧明
引言
灵芝(Ganoderma lucidum)是我国一种传统中药材，含有多种生物活性物质，包括多糖、三萜类、生物碱等。灵芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharide，GLP)是灵芝中主要的生物活性物质之一，因其具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节活性等药理作用[13]，一直备受国内外研究人员关注。根据目前的研究，灵芝多糖主要是由D葡萄糖、D半乳糖、D果糖、D甘露糖、L阿拉伯糖等单糖组成[4]。因此，灵芝多糖的生物活性也受到单糖的组成成分、比例等因素的影响，单糖组成过分单一，会影响灵芝多糖的生物活性。同时，其多糖的提取方法，也可能影响灵芝多糖的结构稳定性，从而影响灵芝多糖的生物活性。发酵培养产生灵芝多糖包括胞外多糖和胞内多糖，其中胞外多糖在发酵液中易于提取。当前，对于灵芝胞内多糖的提取方式，主要包括热水浸提法、酸碱法、酶解法、微波提取法和超声提取法等[56]。其中，热水浸提法，因其操作简单，提取多糖稳定，所以比较常用。对于真菌多糖的测定方法，主要包括苯酚硫酸法，蒽酮硫酸法，3,5—二硝基水杨酸显色法等[7]。其中，苯酚硫酸法因其稳定性比较高，操作简单，是目前比较理想的真菌多糖测定方法。对于灵芝菌株的培养，主要应用深层液体发酵技术。随着灵芝全基因组序列的公布[8]，传统的发酵调控手段，如改变发酵条件、添加诱导物质等，已很难显著提高灵芝多糖的产量。通过分子生物学手段调控基因表达，已经成为提高灵芝多糖合成的有效方法。已有研究报道，可以通过调控多糖合成相关基因的表达，从而有效的提高胞外多糖的产量[8]。
血红素加氧酶(heme oxygenase)是催化降解血红素的限速酶，是一种几乎存在于所有真核细胞中的关键性酶。包括HO1，HO2，HO3三种类型的同工酶，其中HO1为组成型酶，主要发生在转录水平进行调控，HO2和HO3在生物体内的表达量相对较低[9]。当前对血红素单加氧酶的报道主要是动植物方面，微生物方面还较少。
灵芝多糖的生物合成途径主要包括三个阶段：单糖供体的合成、多糖链的连接和多糖的胞外输出[8]。目前，对于单糖供体的合成途径已经逐渐清晰，有研究表明磷酸葡萄糖变位酶(PGM)、磷酸葡萄糖异构酶(PGI)、磷酸甘露糖异构酶(PMI)、葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)是其关键酶[10]。其中PGM催化葡萄糖1磷酸与葡萄糖6磷酸之间的转化，PGI催化葡萄糖6磷酸与果糖6磷酸之间的转化，PMI催化果糖6磷酸生成甘露糖6磷酸，UGP催化葡萄糖1磷酸生成UDP葡萄糖。Tang等人发现磷酸葡萄糖变位酶(PGM)活性与灵芝胞外多糖产量呈线性相关[11]。本研究通过对血红素单加氧酶基因沉默对灵芝胞内多糖和胞外多糖产量的影响[12]进行测定；考察灵芝多糖合成过程中相关酶基因的转录水平，分析引起多糖合成变化的原因，为提高灵芝多糖产量的研究提供依据。
材料与方法
1.1 材料
供试菌株：野生型灵芝菌株、正常转化质粒基因沉默灵芝菌株、血红素加氧酶基因沉默灵芝菌株
主要试剂：95%乙醇、NaOH、5%苯酚、浓硫酸、RNA提取试剂(RNAiso Plus)、氯仿、异丙醇、70%乙醇、DEPC、ABM公司的SYBR Green I Mix试剂盒
培养基：CYM培养基(/L)：葡萄糖 20 g，麦芽糖 10 g，酵母粉 2 g，蛋白胨 2 g，MgSO47H2O 0.5 g，KH2PO4 4.6 g，配制固体培养基需要加入0.8%琼脂
1.2 方法
1.2.1 灵芝胞外多糖的提取
将0.5 mL培养7 d的过滤并去除菌丝的培养液与4倍体积的浓度95%的乙醇溶液混合均匀；
20℃，醇沉过夜；
3000 g离心10 min，弃上清，烘干沉淀；
用0.5 mL的1 M NaOH溶解沉淀，60℃水浴1 h；
取样，用苯酚硫酸法[13]检测供试灵芝菌株胞外多糖的含量。
1.2.2 灵芝胞内多糖的提取
将培养7 d的菌丝用水反复冲洗，60℃烘干；
将烘干后的菌丝磨碎，取0.1 g用15 mL的1 M NaOH溶液进行溶解；
混匀后，65℃水浴3 h，间或摇匀；
10000 g离心10 min，取上清，用苯酚硫酸法检测供试灵芝菌株胞内多糖含量。
1.2.3 苯酚硫酸法测定灵芝多糖含量
取0.5 mL样品与0.5 mL的5%的苯酚混合均匀后，再加入3 mL的浓硫酸，室温反应30 min，测定OD为490时的吸光值。
标准曲线的绘制：

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/606553.html