几丁质，也叫甲壳素，是自然界中广泛存在的一种生物大分子，也是组成真菌细胞壁的重要物质，在农业上被看作是防治真菌病害的重要作用靶点。几丁质酶具有专一性识别几丁质并将其降解为小分子糖的功能。在近几年的报道中，几丁质酶在多种生物体内均有发现，主要是细菌等微生物，也存在于部分高等生物体内。本实验以实验室所保存的一株珊瑚球菌Corallococcus sp. EGB作为研究对象，从该菌基因组中克隆鉴定出一种几丁质酶CcCti1。通过对CcCti1进行序列比对分析后发现该酶属于几丁质酶的GH18家族，之后进一步对该酶的酶学特性进行研究，发现该酶的最适pH为6.0，pH范围在5.0-9.0之间仍能保持稳定；最适温度为50℃，在20℃-50℃范围内仍能保持相对稳定的活性。基于这些结果推测几丁质酶CcCti1具有较好的环境适应能力和重要的应用潜力。
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言4
1 材料与方法6
1.1 实验菌株与器材6
1.1.1 生物材料6
1.1.2培养基6
1.1.3试剂与仪器7
1.2 粘细菌来源的几丁质酶目的基因的克隆与表达载体构建7
1.2.1培养菌株7
1.2.2测定几丁质酶的酶活力7
1.2.3提取待测菌株的总DNA7
1.2.4 制备感受态细胞7
1.2.5 感受态细胞的转化8
1.2.6 提取质粒8
1.3 几丁质酶基因的重组表达菌株的构建8
1.3.1表达载体的构建8
1.3.2 表达菌株的构建8
1.4 几丁质酶的诱导表达9
1.5 几丁质酶的纯化与酶学特性研究9
1.5.1 重组蛋白的纯化9
1.5.2重组几丁质酶CcCti1的底物特异性9
1.5.3重组几丁质酶CcCti1的酶学性质探究9
2结果与分析9
2.1 几丁质酶基因的克隆10
2.2 几丁质酶CcCti1的系统发育树与蛋白序列分析10
2.3 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ￥351916072￥ 
重组几丁质酶的异源表达与纯化11
2.4 重组几丁质酶CcCti1的酶学特性研究11
2.4.1 重组几丁质酶CcCti1的底物特异性12
2.4.2 pH和温度对重组几丁质酶CcCti1的影响12
3 讨论13
3.1 实验总结13
3.2 课题的创新与不足之处13
致谢13
参考文献13
珊瑚球菌EGB来源的几丁质酶的异源表达及酶学特性研究
引言
引言
如何减少由真菌病原菌造成的经济损失，是各国发展农业时都要面临的问题。真菌的细胞壁中富含几丁质，目前的研究报道证明了几丁质酶是一种具有潜在应用价值的广谱抗真菌蛋白。粘细菌是一类在生物防治领域颇受关注的生防细菌，其生长过程中所产生的真菌细胞壁水解酶在粘细菌抗真菌过程中发挥着重要的作用，对其性质的研究将有助于了解粘细菌的抗菌机制，同时也为生物防治真菌病害提供了新型基因资源。
1 几丁质的分类
几丁质，又称甲壳素，分子式为（C8H13O5N)n，由N乙酰氨基葡萄糖在β1,4糖苷键的作用下构成。几丁质是自然界含量第二的碳基高分子化合物，在生物体内广泛存在，也是唯一一种天然碱性多糖[1]，同时是世界排名第二的含氮化合物[2]。几丁质不仅是海洋中甲壳动物外骨骼的重要组成部分，还参与构成真菌的细胞壁，同时大量参与构建无脊椎动物和昆虫的内部结构[3]，此外几丁质还可作为部分细菌的碳源供给物。科学家们把几丁质按照分子排列的不同，划分成α几丁质、β几丁质和γ几丁质三类[4]，已知这三类中世界上含量最为丰富的是α几丁质，它拥有致密稳定的排列结构，在自然界中被大量用于组成生物的保护结构如真菌的细胞壁、甲壳动物的外壳以及昆虫的外骨骼；自然界中最为稀少的是β几丁质，它内部的排列结构基本是平行排列，故而结构疏松，目前主要在鱿鱼软骨中发现；γ几丁质中的多糖链则是有平行和反平行两种排列方式，在自然界中并不常见[5]。


图1 几丁质的分子结构图[6]
几丁质可以被降解为无毒且溶解性较高的几丁寡糖，几丁寡糖有着抗菌、抗氧化和抗肿瘤等特性[7]，在医学领域受到了广泛的关注。
2 几丁质酶的认识
十九世纪初，科学家贝内克首次分离并命名了Bacillus chitinovirous这种可以通过分解几丁质来获取营养物质的微生物[8]。在此后的时间里，科学家们已经从自然界中的多种生物体内分离并鉴定出诸多几丁质酶，根据统计结果显示，目前已经发现可以生成几丁质酶的微生物有五十多个属多达百种，这些微生物基本都来自于真菌、细菌和放线菌。研究人员通过提取这些几丁质酶并对其进行分离纯化，进而对酶的理化性质、生物活性等特征展开了大量深入的研究，根据统计出的研究结果发现这些来自微生物的几丁质酶会因为菌株的不同而具有不同的特性，以pH条件为例，酵母菌中的几丁质酶耐酸性较好，最适pH在1.5至2.5之间；链霉菌属的几丁质酶则拥有一定的耐碱性，在pH值为8至14的环境下依然可以保持50%以上的活性；来自细菌、放线菌的几丁质酶最适pH值则处于4至7的范围内[9]。
几丁质酶是一种糖苷水解酶，能够对几丁质专一性识别并将其分解成N乙酰D葡萄糖胺(GlcNAc)和几丁寡糖（CHOS）。在近几年的报道中，几丁质酶陆续被发现于真菌、细菌等微生物中，甚至在一些动植物等高等生物体内也有发现它们的存在[10]。不同生物体内的几丁质酶需要承载不同的生物功能，如细菌需要借助几丁质酶分解几丁质来获得碳源；真菌需要几丁质酶来完成细胞壁中几丁质的形态变化；而植物体内的几丁质酶则是宿主防御系统的重要组成部分[11]。科学家们通过对比不同几丁质酶对底物的作用位点和水解产物的区别，将其分为三类：分别是内切、外切几丁质酶与N乙酰氨基葡萄糖苷酶[12]。此外，根据由CAZy数据库提供的序列，从进化角度把几丁质酶又归纳为GH18、GH19和GH20三个糖苷水解酶（GH）家族,其中GH18家族的几丁质酶广泛存在于包括微生物和动植物在内的多种生物体内[13]，而GH19家族的相似性比对显示，最初该酶的基因是由植物基因转移获得的，故GH19家族的几丁质酶大部分被发现于植物和一些细菌的体内。通过近几年对几丁质酶的研究，人们发现几丁质酶在抗菌、抗癌、制备原生质体等方面均有重要潜力[6]。
3 粘细菌有重要的生物防治功能

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/606543.html